Immobilizzazione di sequenze oligonucleotidiche su Sistemi MicroElettroMeccanici per la realizzazione di microbiosensori per applicazioni bioanalitiche

Un biosensore è un dispositivo analitico che accoppia un sistema di riconoscimento molecolare con un trasduttore che converte l’evento in un segnale elettronicamente misurabile. Lo scopo del biosensore è quello di fornire un segnale proporzionale alla concentrazione di analita, e le applicazioni più rilevanti sono quelle legate alla diagnostica clinica. Sebbene la bioelettronica, ovvero la scienza che si occupa dello sviluppo dei biosensori, sia un campo relativamente maturo, essa continua a mostrarsi un'area di ricerca molto attiva. La rilevazione di eventi, processi ed elementi biologici trova sempre maggiori ed importanti applicazioni. Da ciò la necessità di studiare e progettare biosensori che offrano migliori prestazioni in termini di sensibilità, facilità di utilizzo e costo. Negli ultimi anni si è osservato, infatti, un significativo sviluppo nelle tecnologie di tali apparecchi. In particolare, gli avanzamenti nell’ambito della nano- e micro-tecnologia hanno fatto sì che si sviluppasse, negli ultimi decenni, un crescente interesse verso dispositivi miniaturizzati su scala micrometrica di cui i MEMS (Sistemi MicroElettroMeccanici) ne sono un esempio rappresentativo. La presente Tesi di Laurea si colloca all’interno di un progetto PRIN nato dalla collaborazione fra l’Università di Pisa, l’Istituto di Fisiologia Clinica del C.N.R. di Pisa e l’Università degli Studi di Bari “Aldo Moro”, il cui scopo principale è quello di dimostrare la capacità di un microbiosensore (BioMEMS) di determinare, grazie ad una specifica funzionalizzazione, la concentrazione di un marker di interesse diagnostico. L’obiettivo primario del mio lavoro di Tesi è stato quello di mettere a punto una tecnica di immobilizzazione del biorecettore scelto sulla parte sensibile dei dispositivi micromeccanici, basati su una tecnologia CMOS sviluppati presso il Dipartimento di Ingegneria dell'Informazione E.I.T. dell’Università di Pisa. Considerando il fatto che la determinazione di mRNA specifici è estremamente importante sia nel campo della ricerca di base che in campo diagnostico e farmacologico, si è pensato di scegliere come biorecettori dei probe oligonucleotidici capaci di riconoscere e legarsi tramite l’accoppiamento base-specifico degli acidi nucleici con l’mRNA bersaglio. Come oligonucleotide modello è stata utilizzata una sequenza di 25 nucleotidi che lega l’RNA messaggero che codifica per la proteina MGMT (MetilGuaninaMetilTransferasi), un enzima coinvolto nella riparazione del DNA. Tale sequenza è stata scelta in quanto era già stata utilizzata in precedenti lavori sperimentali dal gruppo di ricerca che lavora nei laboratori dove ho eseguito gli esperimenti finalizzati al mio elaborato di tesi. L’omogeneità delle caratteristiche chimico-fisiche degli oligonucleotidi che, al contrario dei peptidi e delle proteine, sono molto simili tra loro indipendentemente dalla sequenza dei monomeri che li compongono, rende possibile l’estensione delle tecniche di immobilizzazione messe a punto per una data sequenza a tutte le altre di lunghezza simile. In particolare, in una prima fase ho effettuato simulazioni su vetrini coprioggetto e su supporti di ossido di silicio della medesima natura del dispositivo micromeccanico in via di sviluppo in modo da ottimizzare le condizioni e i tempi di reazione prima di effettuare la funzionalizzazione del risonatore MEMS, riducendo in questo modo il numero di chip utilizzati e minimizzando così i costi di produzione dei dispositivi micromeccanici stessi. Il processo di immobilizzazione del biorecettore su supporti solidi ha richiesto diversi passaggi: (a) sililazione con un organosilano che lega covalentemente i gruppi silanoli della superficie dei derivati del silicio (si è deciso di effettuare tale reazione con un amminosilano), (b) attivazione della superficie (è stato utilizzato un cross-linker eterobifunzionale), (c) immobilizzazione vera e propria, dopo aver effettuato una riduzione del probe tiolato da immobilizzare. Si è trattato dunque di un lavoro portato avanti step by step e che ha richiesto un monitoraggio costante ad ogni passaggio. I risultati ottenuti dal controllo delle superfici modello, attraverso delle analisi con microscopio a fluorescenza e fluorimetri, hanno dimostrato che la tecnica di immobilizzazione utilizzata è corretta e appropriata. La caratterizzazione dei dispositivi MEMS, ossia la verifica del funzionamento del dispositivo quale microbilancia sensibile ad uno specifico trascritto di RNA, ha dimostrato che durante il processo di funzionalizzazione si può verificare un danneggiamento meccanico di alcuni dei risonatori presenti sui chip o, più frequentemente, dei loro contatti elettrici. Ciò è dovuto al fatto che si tratta di dispositivi estremamente delicati che risentono degli stress meccanici ai quali vengono sottoposti. Questi problemi sono in gran parte dovuti al fatto che su un singolo chip sono presenti diversi risonatori di varie dimensioni (dato che per la loro ottimizzazione vengono studiate diverse geometrie e dimensioni) e le fragili connessioni elettriche sono molto esposte. Tuttavia, i risonatori che non sono stati danneggiati durante le fasi di immobilizzazione hanno dato un segnale congruo con la presenza del target. La tecnica di funzionalizzazione dei dispositivi con sonde oligonucleotidiche messa a punto in questo lavoro di tesi, fornendo strati sensibili omogenei e riproducibili, utilizzando condizioni di reazione blande e ridotti quantitativi di reagenti, apre quindi interessanti prospettive per la funzionalizzazione di MEMS con varie geometrie e modalità di trasduzione