Valutazione del profilo farmacocinetico di farmaci COX-2-inibitori/donatori di NO

Riassunto analitico L’ossido d’azoto (NO) è un gas solubile, capace di attraversare facilmente le membrane biologiche e con importanti funzioni a livello del sistema cardiovascolare, nervoso e immunitario. È uno stimolante endogeno della guanilato ciclasi citosolica e, una volta prodotto, determina un aumento di GMPc intracellulare. È responsabile della dilatazione dei vasi sanguigni, dell’inibizione dell’aggregazione piastrinica, dell’inibizione della proliferazione cellulare e della regolazione della struttura vascolare. Dunque, l’NO svolge un’importante azione protettiva cardiovascolare e una sua ridotta produzione può provocare l’insorgere di svariate patologie. I COXIB (inibitori selettivi della COX-2) sono una classe di farmaci utilizzati per il trattamento del dolore acuto e cronico derivante da stati infiammatori; la loro ridotta tossicità gastrointestinale, rispetto ai FANS tradizionali, è dovuta alla mancata inibizione dell’enzima COX-1. L’inibizione dell’ enzima COX-2, costitutivo a livello cardiovascolare, determina la mancata formazione da parte dell’endotelio vascolare di PGI2 (un potente vasodilatatore ed antiaggregante piastrinico). Pertanto, se da un lato viene evitato l’effetto gastrolesivo tipico dei FANS tradizionali, dall’altro aumenta il rischio cardiovascolare. La ricerca è stata indirizzata alla sintesi di nuovi farmaci ibridi, che presentassero la capacità di inibire l’enzima COX-2 e allo stesso tempo di rilasciare NO, in maniera tale da sopperire al deficit di PGI2. L’NO, infatti, determinando vasodilatazione, inibizione dell’aggregazione piastrinica, modulazione dell’ adesione piastrinica e dei leucociti a livello endoteliale, potrebbe portare ad un minor danno cardiovascolare indotto dai coxib. È stata, a tale riguardo, sviluppata una nuova classe terapeutica per il trattamento dell’infiammazione e del dolore acuto e cronico, che prende il nome di CINOD (Inibitori della Ciclossigenasi NO-Donor). Questi derivati sono ottenuti da farmaci antiinfiammatori non steroidei, COX-2 inibitori selettivi, ai quali è stata coniugata una porzione in grado di rilasciare ossido d’azoto. I CINOD hanno manifestato effetti terapeutici non solo nella cura del dolore derivante da stati infiammatori, ma anche in altre patologie; riescono ad abbassare la pressione sanguigna nei ratti ipertesi senza mostrare effetti di ipotensione e l’incidenza di edemi si abbassa. I modelli animali hanno permesso anche di stabilire che i CINOD hanno incrementato le attività anti-trombotiche rispetto all’aspirina. I risultati preliminari di studi su modelli animali suggeriscono, dunque, che i CINOD potrebbero essere associati ad una bassa incidenza di questi effetti a livello cardiovascolare. Tra i farmaci appartenenti alla classe dei CINOD grande importanza hanno i MAB e i VA, attualmente in fase di studio presso il Laboratorio di Farmacologia del Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie dell’Università di Pisa; in particolare, hanno mostrato grande interesse il MAB137 ed il MAB170. Lo scopo della presente tesi è stato quello di sviluppare e validare una metodica HPLC che permetta di determinare le concentrazioni plasmatiche dei composti MAB 137 e MAB 170 ed inoltre di studiare i parametri farmacocinetici di tali molecole e di valutare se esse vengono metabolizzate, in modelli animali in vivo, in maniera tale da rilasciare sia NO che metaboliti che possiedano ancora un’attività antiinfiammatoria, rispettivamente MAB 145 e MAB 171. Le condizioni cromatografiche, scelte in seguito a numerose prove sperimentali, sono state quelle che hanno mostrato una migliore definizione e separazione dei picchi cromatografici e migliori tempi di ritenzione dei quattro composti in esame, MAB 137, MAB 145, MAB 170 e MAB 171. In particolare, le corse cromatografiche sono state effettuate in gradiente di concentrazione, utilizzando un fase mobile costituita da 20% CH3CN e 80% di CH3COOH 0.01 M pH 3(0-2.5 min), 60% CH3CN e 40% di CH3COOH 0.01 M pH 3 (2.5-10 min), 20% CH3CN e 80% di CH3COOH 0.01 M pH 3 (10-15 min). È stata utilizzata una colonna cromatografica C18, un flusso di 1.2 ml/min ed una lunghezza d’onda di 330 nm. Nelle condizioni cromatografiche ottimizzate sono state effettuate le analisi cinetiche dei composti MAB 137 e MAB 170. Per il MAB 137 e per il suo metabolita, MAB 145, è stato scelto un modello cinetico bicompartimentale dopo somministrazione orale e monocompartimentale dopo somministrazione endovenosa. Tuttavia, il MAB 137 si è dimostrato un composto piuttosto instabile e dunque è stato scartato per un possibile sviluppo futuro. Per il MAB 170 è stato scelto un modello cinetico bicompartimentale dopo somministrazione endovenosa, mentre le concentrazioni ottenute dopo somministrazione orale erano troppo basse e vicine al limite di quantificazione del metodo, a dimostrazione che il farmaco viene poco assorbito per questa via di somministrazione. In conclusione la metodica sviluppata nella presente tesi ha consentito di determinare e quantificare i MAB 137 e 170 ed i relativi composti correlati nel plasma di ratti, con buoni recuperi, corse brevi e picchi ben risolti. Tale metodica è stata utilizzata per lo studio della cinetica dei MAB 137 e 170 dopo somministrazione sia orale sia endovenosa