Ricerca di Norovirus e HAV in molluschi bivalvi con metodi biomolecolari: confronto di diversi protocolli ed applicazione sul campo.

I Norovirus (NoV), membri della famiglia Caliciviridae, sono agenti responsabili di gastroenteriti acute nell’uomo e vengono rilasciati nell’ambiente ad alte concentrazioni. Geneticamente possono essere suddivisi in cinque genogruppi distinti: il genogruppo I (NoV GI) e il genogruppo II (NoV GII) sono responsabili della maggioranza di casi clinici umani. Il virus dell’epatite A (HAV) appartiene al genere Hepatovirus, famiglia Picornaviridae, ed è riconosciuto come un’importante causa di epatiti virali acute nell’uomo in tutto il mondo. HAV e NoV, stabili nell’ambiente e resistenti all’inattivazione, trasmessi soprattutto per via oro-fecale, causano frequentemente rischi sanitari legati alla contaminazione dei cibi, in particolar modo dei molluschi bivalvi soprattutto se consumati crudi o poco cotti. L’approccio molecolare per la diagnosi di questi virus nei molluschi bivalvi presenta diverse problematiche che rendono difficoltosa la loro rilevazione in queste matrici, sia a causa dei bassi livelli di contaminazione che per la difficoltà di ottenere un’estrazione efficiente. La presenza d’inibitori della PCR può inoltre influire negativamente sull’efficienza di amplificazione della Real Time RT-PCR. Nel presente lavoro è stato effettuato un confronto tra due diverse metodiche di estrazione dell’RNA virale da molluschi bivalvi al fine di valutare le rispettive efficienze di estrazione, utilizzando un controllo di processo (FCV) co-estratto, e di amplificazione, utilizzando come controllo di amplificazione l’RNA virale di NoV GII co-amplificato. Ventiquattro campioni di epatopancreas di Mytilus edulis, Donax trunculus, Crassostrea gigas e dodici di Chamelea gallina sono stati estratti e contaminati con FCV e sottoposti ad estrazione con il kit 1 (QIAamp Viral RNA Mini Kit, QIAGEN) ed il kit 2 (Nuclisens® Minimag®, bioMerieux). Gli RNA estratti con le due diverse metodiche sono stati sottoposti a Real Time RT-PCR per la valutazione dell’efficienza di estrazione ed amplificazione. Al fine di avere a disposizione controlli positivi e sviluppare una Real Time RT-PCR quantitativa sono stati allestiti i plasmidi contenenti il retrotrascritto di NoV GI, NoV GII e HAV. Il confronto dei due kit testati sulle diverse matrici ha messo in evidenza notevoli differenze a seconda del kit scelto, ed in particolar modo ha evidenziato nel complesso migliori efficienze per il kit 2 rispetto al kit 1 su questo tipo di campioni. Un’alta variabilità è emersa inoltre tra le diverse matrici testate per entrambe le efficienze dei due kit utilizzati. La costituzione del plasmide contenente il retrotrascritto di NoV GI, NoV GII e HAV e del loro trascritto ha permesso di sviluppare un metodo quantitivo oltre che qualitativo