Analisi del pattern di espressione dei miRNA intracellulari ed extracellulari in linee tumorali di prostata esposte a farmaci citotossici.

Recentemente è stato scoperto che i miRNA stabilmente espressi in diversi fluidi corporei di molti animali (miRNA circolanti) possono rappresentare un utile strumento diagnostico e/o predittivo di malattia. Poiché i miRNA circolanti sono anche stati trovati stabilmente espressi nel mezzo di coltura di cellule tumorali nel progetto di tesi ci siamo proposti di verificare se i) le linee tumorali metastatiche di prostata PC3 e DU-145 rilasciano gli stessi miRNA ritrovati nel sangue di pazienti con cancro alla prostata; ii) i livelli di espressione intracellulari dei miRNA influenzano quelli extracellulari; iii) il pattern di espressione di miRNA intracellulari ed extracellulari viene alterato da trattamenti chemioterapici. E’ stato scelto un gruppo di miRNA (PCS-miRNA: Prostate Cancer Secretory miRNAs), sovraespressi nel plasma di pazienti con cancro alla prostata (miR-21, miR-100, miR-200a, miR-200b, miR-328 e miR-485-3p), e un gruppo di miRNA (NS-miRNA: Non Secretory miRNAs), con nota funzione di tumor suppressor in vari tipi di tumori (miR-26, miR-28, miR-34, miR-145 e Let7b). I dati ottenuti indicano che i miRNA ritrovati nel sangue di pazienti con cancro alla prostata sono anche rilasciati nel mezzo di coltura dalle linee tumorali PC3 e DU-145 e che esiste una correlazione positiva tra i livelli di espressione intracellulari ed extracellulari. Per verificare se il rilascio dei miRNA nel mezzo di coltura è un processo modulabile, cellule PC3 e DU-145 sono state esposte a concentrazioni inibitrici della proliferazione cellulare di un farmaco chemioterapico specifico (Taxotere) e non specifico (Fludarabina) per il trattamento del tumore alla prostata. Entrambe i farmaci hanno modificato il profilo di espressione dei miRNA extracellulari. Nello specifico il trattamento con taxotere ha indotto un aumento del livello di espressione sia dei PCS-miRNA che dei NS-miRNA extracellulari mentre il trattamento con fludarabina ne ha ridotto il livello di espressione. Per spiegare gli effetti contrapposti, è stata determinata la proliferazione cellulare a vari tempi di esposizione al taxotere e alla fludarabina e ad ogni tempo è stato analizzato il ciclo cellulare. Il time course della proliferazione ha messo in evidenza che i due chemioterapici inibivano la proliferazione delle cellule trattate. L’analisi del ciclo cellulare ha mostrato che il taxotere riduceva la proliferazione attraverso un progressivo shift dalla fase G1 alla fase G2 accompagnato da morte cellulare mentre la fludarabina induceva accumulo in fase G1 senza apparente induzione di morte cellulare. Dall’analisi dei livelli di espressione dei miRNA intracellulari delle cellule trattate con fludarabina è emerso che i miRNA che erano upregolati all’interno delle cellule erano sottoespressi nel mezzo di coltura mentre i miRNA che erano downregolati all’interno delle cellule erano sovraespressi nel mezzo di coltura. Questo suggerisce che la fludarabina induce ritenzione/rilascio di miRNA specifici. Nel complesso da questi dati si può concludere che i) un aumento rilascio generalizzato dei PCS-miRNA e dei NS-miRNA è indicativo di induzione di morte cellulare e quindi di efficacia terapeutica del farmaco; ii) i miRNA possono essere ritenuti/rilasciati in maniera specifica suggerendo una loro rilevanza per la sopravvivenza cellulare e/o la comunicazione tra cellule