Rischio virale associato alla produzione alimentare con particolare riferimento alle insalate di IV gamma.

Gli alimenti possono costituire un veicolo per agenti patogeni e condurre all'insorgenza di patologie nell'uomo. Evidenze epidemiologiche indicano che i virus enterici sono la principale causa di malattie di origine alimentare nei paesi sviluppati. La maggior parte delle infezioni di origine alimentare è dovuta ad un contatto oro-fecale e gli alimenti che principalmente si associano a focolai di gastroenteriti ed epatiti sono rappresentati da quelli che vengono consumati crudi, tra cui le insalate. Dal momento che l'ingestione di poche particelle virali infettive può condurre ad infezione, le insalate contaminate costituiscono un rischio per il consumatore. Inoltre, non essendo obbligatoria per legge la ricerca dei virus enterici, diventa molto importante a questo proposito un monitoraggio per la valutazione e il controllo del rischio. Lo scopo della tesi è quello di valutare il rischio di contaminazione virale in matrici alimentari, con riferimento a piantine di insalata (Lactuca sativa) coltivate in coltura idroponica, ossia con la stessa tecnica che viene impiegata per la realizzazione delle colture di IV gamma.Inoltre, vengono valutate la presenza e la sopravvivenza del virus a diverse diluizioni. Per valutare l'efficienza della tecnica relativamente al recupero virale, sono state condotte prove su foglie artificialmente contaminate con virus (Coxsackie B2) a titolo dell'ordine di 10^7 MPN/ml e 10^7 GC/ml. Su ogni foglia sono stati seminati 1,15x10^6 MPN e 7,7x10^5 GC di virus e ad ogni fase del processo di eluizione (agitazione, centrifugazione, filtrazione) e dopo concentrazione con PEG si è indagata la concentrazione virale per valutare la percentuale di recupero finale. Per ciascuna di queste fasi sono state perciò prelevate delle aliquote e sottoposte ad analisi tramite colture cellulari e biologia molecolare. I risultati ottenuti tramite i metodi colturali hanno mostrato dopo l’agitazione un recupero di 3,72x10^3 MPN; dopo centrifugazione e filtrazione sono stati recuperati 3,3x10^3 MPN. La biologia molecolare ha fornito, mediamente, i seguenti dati: 2,85x10^3 GC dopo agitazione, 2,59x10^3 GC dopo centrifugazione, 2,16x10^3 GC dopo filtrazione. La fase di concentrazione rappresenta un punto di criticità, in quanto è stata evidenziata una perdita di sensibilità della tecnica; perciò è possibile che il PEG interferisca con l’infettività. A livello della fase di filtrazione, la tecnica ha mostrato un’efficienza di recupero pari allo 0,2%. Le prove sperimentali sono state condotte su piantine di insalata coltivate in coltura idroponica in apposite vasche contenenti soluzione nutritiva contaminata con virus (Coxsackie B2) a titolo noto. Sono state effettuate tre diluizioni (intero, 10-1, 10-2) e testate in doppio, oltre ad un controllo senza virus. Sono state condotte due prove: la prima, su un periodo di 10 giorni, per valutare l’ipotesi di assorbimento tramite le radici e la permanenza virale nei tessuti vegetali; la seconda, su un periodo di 4 giorni, per valutare quantitativamente la presenza di virus nelle foglie e l’andamento della presenza del genoma parallelamente all’infettività. Le piante, una volta prelevate, sono state sottoposte ad eluizione utilizzando il “Tris Glycine Beef Extract” (TGBE) come eluente. Gli eluati sono stati concentrati con PEG (Polyethylene Glycol), sottoposti a trattamento al cloroformio e poi di ciascuno un'aliquota è stata destinata ad analisi tramite biologia molecolare e un'altra ad analisi mediante colture cellulari. Attraverso le tecniche di biologia molecolare è stato estratto l'RNA col kit di estrazione QIAamp Viral RNA Qiagen ed è stata indagata la presenza del virus tramite PCR qualitativa e quantitativa. Mediante le colture cellulari è stato determinato il titolo del virus (espresso in MPN/ml) e ne è stata valutata l’infettività; applicando il metodo MPN (“most probable number”) è possibile stimare il numero più probabile di particelle virali espresso come MPN/g di foglia. Dalla prima prova è stata rilevata positività nei campioni contaminati con il virus all’intero (corrispondente ad un titolo di 2,2x10^4 GC/ml e 3,6x10^3 MPN/ml in acqua) il primo giorno dopo la contaminazione per entrambe le repliche, il terzo, sesto e ottavo giorno dopo la contaminazione per una delle due repliche. I test di infettività hanno dato risultati negativi relativamente ai campioni positivi alla PCR. Nella seconda prova, in cui l’acqua è stata contaminata con 10 ml di sospensione virale a titolo di 2x10^8 MPN/ml e 4,2x10^8 GC/ml, è stata osservata positività fino al quarto giorno: nel caso delle analisi tramite metodi molecolari, c’è positività a tutte le diluizioni, con l’eccezione della diluizione -2 l’ultimo giorno; a seguito delle analisi condotte con metodi colturali è stata riscontrata positività tutti i giorni a tutte le diluizioni. Questo studio ha dimostrato la possibilità di assorbimento del virus attraverso le radici e il suo trasporto alle foglie, nonostante le dinamiche di questa penetrazione e dell’inattivazione virale siano ancora poco chiare. Inoltre dai dati ricavati si può desumere che quando le radici sono a contatto con acque contaminate a concentrazione virale superiore a 10^3 GC/ml, è possibile avere penetrazione a livello delle foglie. Alla luce di ciò risulta necessaria una valutazione della qualità delle acque da un punto di vista virologico, soprattutto per quelle destinate all’irrigazione di verdure consumate crude