Studio della regolazione da parte di Tbx5 del miRNA 218 e del ruolo di quest'ultimo nello sviluppo cardiaco del Danio rerio.

Tbx5 è un fattore di trascrizione coinvolto nel differenziamento cellulare dei cardiomiociti e nella morfogenesi cardiaca. Nell’uomo la mutazione di questo gene causa diverse forme di malformazioni cardiache e degli arti superiori, che si riconoscono nella sindrome di Holt-Oram. Analisi bioinformatiche e studi di microarrays hanno posto in evidenza come a valle di Tbx5 vengano regolati tutta una serie di geni che sono a loro volta coinvolti nello sviluppo cardiaco. Inoltre, alcuni dei geni regolati da Tbx5 contengono al loro interno dei microRNA che vengono attivamente espressi, e partecipano a loro volta a regolare ed affinare tutto il processo di differenziamento cellulare e morfogenesi del tessuto cardiaco. Lo studio da me condotto prende in esame in particolare i geni slit 2 e slit 3, importanti per lo sviluppo neuronale, per i quali è stato recentemente dimostrato un ruolo nella morfogenesi cardiaca. Il mio studio evidenzia il loro rapporto di dipendenza da Tbx5, e valuta le possibili funzioni del miR-218, che si trova all’interno di un introne in entrambi i geni slit. Tutti gli esperimenti sono stanti condotti utilizzando Danio rerio come sistema modello, in quanto l’enorme prole prodotta giornalmente, la semplicità morfologica del cuore, ed il suo precoce sviluppo lo rendono ideale per studi di cardiogenesi. Inoltre, le prime fasi di sviluppo di Danio rerio avvengono anche in assenza di un apparato cardiocircolatorio funzionante, il che è ottimale per studiare totali o parziali disfunzioni di esso. I geni e i miRNA sopracitati sono stati studiati soprattutto tramite tecniche di microiniezione, valutando quindi i difetti morfologici e funzionali che una loro sovra- o sotto-regolazione provocavano nelle prime fasi di sviluppo. I mutanti ottenuti con le microiniezioni sono stati analizzati tramite ibridazioni in situ per caratterizzare i geni deregolati. L’espressione dei geni e dei microRNA in studio è stata, infine, alterata mediante microiniezione in linee transgeniche esprimenti GFP o RFP sotto il promotore di geni specifici per il miocardio (cmlc2) o per l’endotelio (flk1). Questo approccio ha permesso di valutare in maggiore dettaglio, tramite microscopia confocale, l’alterazione morfologica del cuore o dei vasi conseguente a tale deregolazione. Le analisi condotte hanno rivelato come la funzione di Tbx5 e del miRNA 218 siano strettamente connesse in processi riguardanti la morfogenesi cardiaca e come entrambi svolgano dei ruoli sia nella crescita che nella giusta strutturazione delle camere cardiache. Inoltre è stato definita una finestra temporale nella quale il miRNA 218 riesce a svolgere la sua azione, prima della quale non sembra avere effetto. Infine è stato dimostrato che la sovra-regolazione del miRNA 218 provoca un’alterazione del pattern di espressione del gene tie 2 un gene molto espresso a livello della valvola atrio-ventricolare