Gli istoni deiminati come target di autoanticorpi e loro ruolo nella patogenesi dell'artrite reumatoide

Gli anticorpi anti-proteine/peptidi citrullinati (ACPA) sono una famiglia di anticorpi diretti contro sequenze peptidiche in cui l’arginina è sostituita dalla sua forma deiminata, l’aminoacido non naturale citrullina. Gli ACPA sono presenti esclusivamente nei sieri di artrite reumatoide (AR); la loro presenza è un importante criterio per la diagnosi di AR, mentre poco si conosce riguardo al loro ruolo patogenetico. La deiminazione è catalizzata da un enzima Ca-dipendente, la peptidil-arginin-deiminasi o PAD. Alcune proteine dell’organismo sono fisiologicamente deiminate (filaggrina, proteina basica della mielina) e molte altre possono esserlo a seguito di processi infiammatori (collagene, fibrina). Gli istoni possono essere fisiologicamente deiminati (in questo caso il tipo e l’entità della deiminazione ne modificano la capacità di legarsi alla cromatina, costituendo quindi un importante meccanismo di regolazione genica) oppure possono essere deiminati durante un processo di morte cellulare tipico dei neutrofili e definito NETosi. Lo scopo di questo lavoro di tesi è di valutare: se gli istoni deiminati in corso di NETosi siano riconosciuti dai sieri di pazienti con AR; se gli istoni deiminati possano essere utilizzati come antigeni per la determinazione di ACPA nei sieri di AR; se immunocomplessi ACPA/proteine deiminate possano avere un ruolo patogenetico Granulociti da sangue periferico sono stati stimolati per attivare la PAD e sottoposti a lisi ed estrazione acida. Le proteine basiche estratte in questo modo sono state separate in SDS-PAGE e sottoposte a immunoblotting con i sieri dei pazienti con AR e con anticorpi anti istoni deiminati e non. Abbiamo osservato che i sieri dei pazienti riconoscono bande a peso molecolare compatibile con quello dell’istone H4 nei granulociti stimolati con calcio ionoforo e non in quelli non stimolati. Abbiamo quindi indotto in granulociti da sangue periferico la formazione di NET e purificato le proteine coinvolte in questo processo. Dopo separazione mediante SDS-PAGE e immunoblotting con i sieri dei pazienti con AR e con anticorpi anti istoni deiminati e non, abbiamo osservato che i sieri dei pazienti riconoscono bande a peso molecolare compatibile con quello dell’istone H4 deiminato. L’istone umano purificato H4 è stato quindi sottoposto a deiminazione in vitro ed utilizzato in un test ELISA. Sono stati evidenziati anticorpi specifici per H4 deiminato nel 13% dei sieri di AR. All’interno dell’istone H4, sono state cercate ed identificate 2 sequenze particolarmente ricche di arginina (H4 aa. 14-34 e aa. 31-50), che sono state sintetizzate sostituendo tutte le arginine con citrulline (H4cit). Anticorpi specifici per H4cit 14-34 sono presenti nel 10% dei sieri di AR e per H4cit 31-50 nel 13%. Le sequenze sono state allora sintetizzate come peptidi antigenici multipli (MAP), ottimizzando il test su fase solida: sono infatti positivi il 67% dei sieri di AR su MAP H4cit 14-34 e il 63% su MAP H4cit 31-50, e meno del 5% dei sieri di soggetti normali e di malattie di controllo. Alla luce di questi risultati possiamo concludere che l’attivazione di granulociti e la loro formazione di NET sono eventi che possono contribuire alla produzione di istone H4 deiminato che viene poi riconosciuto dai pazienti con AR. Peptidi citrullinati sintetici da esso derivati possono essere utilizzati come substrato per la determinazione di ACPA nel siero dei pazienti con AR