Contextual fear conditioning: analisi trascrizionale e traduzionale nelle regioni medio temporali del cervello di ratto

Nel condizionamento contestuale alla paura, o contextual fear conditioning (CFC), la risposta è condizionata sia dallo stimolo che determina la paura sia dall’ambiente in cui esso viene presentato. Le regioni cerebrali coinvolte nell’acquisizione e ritenzione di CFC comprendono le aree medio-temporali del cervello. Studi precedenti hanno mostrato che ratti sottoposti a CFC mostrano la risposta di freezing se riposizionati nell’apparato di condizionamento fino a 28 giorni successivi all’addestramento. Registrazioni elettrofisiologiche effettuate su slices di ippocampo di ratti condizionati hanno inoltre evidenziato un aumento dell’eccitabilità nello strato CA1 fino a 7 giorni dall’addestramento, con un picco massimo a 48 h dal condizionamento. Queste effetti prolungati nel tempo hanno suggerito l’ipotesi che si avesse una diversa espressione di alcuni geni nel sistema nervoso dei ratti condizionati rispetto a quelli di controllo non condizionati (naive), traducibile in una sintesi differenziale di mRNA e proteine. Mediante la tecnica dell’ibridazione sottrattiva e soppressiva, sono state precedentemente costruite due librerie geniche utilizzando RNA retrotrascritto in cDNA e ottenuto da porzioni medio-temporali di cervelli di ratti condizionati e di ratti naive sacrificati a 48 h dal condizionamento. Il successivo screening primario ha permesso di isolare molti geni candidati ad essere differenzialmente espressi, di cui 20 sono stati confermati come veri positivi con RT-PCR real time. Nel presente lavoro è stato valutato l’andamento nel tempo dell’espressione di questi 20 geni utilizzando RNA totale retrotrascritto in cDNA ottenuto dall’omogenizzazione di porzioni medio-temporali di cervello di ratti sottoposti a CFC e sacrificati a 72 h, 10 e 20 giorni dal condizionamento e di ratti naive. I 20 geni isolati codificano per proteine coinvolte nella modulazione sinaptica (statmina I, anfifisina I, profilina 2, ARP3, NAPA e complessina I), nel turnoverproteico (TRIM32 e PMP), nell’attività mitocondriale (ATP V6, proteina simile alla dinamina 1 e TOM20), nei fenomeni apoptotici (caspasi3 e p53), nella trasduzione del segnale (PEA 15, PKA RI, 14,3,3 e TIP41) e in processi cellulari vari (Bis-fosfoglicerato mutasi, RAN e nardilisina). L’espressione di ciascuno di questi geni ha mostrato uno specifico andamento temporale dopo le 48 h, quando tutti i geni considerati, ad eccezione del gene per anfifisina I, erano espressi in modo significativamente maggiore rispetto ai livelli costitutivi. Successivamente, mediante Western blot, è stato verificato se alle variazioni di espressione genica corrispondesse una concorde variazione della sintesi proteica: in particolare sono stati saggiati i livelli di sintesi delle proteine statmina I, amfifisina I e profilina 2. Infine, mediante l’uso di anticorpi antistatmina I è stata messa in evidenza una marcata localizzazione della proteina nel giro dentato dell’ippocampo di ratti CFC sacrificati a 48 h dal condizionamento