Caratterizzazione di geni codificanti metalloproteinasi in planaria: la famiglia delle astacine.

La matrice extracellulare (ECM) è una struttura complessa e dinamica che garantisce l’integrità strutturale e fisiologica a tutti i tipi di tessuto. È composta da un insieme di macromolecole estranee alla cellula la cui varietà e combinazione cambiano a seconda del contesto cellulare, influenzando così le proprietà funzionali. La connessione delle cellule alla matrice extracellulare è un requisito di base per la formazione di un organismo pluricellulare, poiché costituisce parte del microambiente all’interno del quale sono ospitate le cellule e ne condiziona direttamente la forma, la funzione e la proliferazione. L’ECM è continuamente soggetta a rimodellamento che avviene sia in condizioni fisiologiche che patologiche: questo rimodellamento condiziona la morfogenesi e la rigenerazione dei tessuti, ma anche l’invasione e la metastatizzazione delle cellule tumorali. Le astacine sono metalloproteinasi, appartenenti alla superfamiglia delle metzincine, comprendenti un gruppo di enzimi versatile e diversificato sia dal punto di vista funzionale che evolutivo. Sono state ritrovate in una varietà di organismi che va dai batteri all’uomo, non ancora in piante e funghi. Il primo membro di questa famiglia è stato isolato nel gambero di fiume Astacus astacus. Attualmente si possono ritrovare nei database di proteine e DNA più di 400 membri appartenenti a questa famiglia. La struttura minima identificata per queste proteine comprende un pro-peptide contenente un peptide segnale, che viene tagliato al momento dell’attivazione dell’ enzima, e un dominio catalitico tipico della famiglia che presenta un motivo legante lo zinco. Le astacine sono implicate in molteplici ruoli fisiologici, alcune svolgono processi digestivi, altre, tra cui BMP-1 ( bone morphogenetic protein -1), isolato nei vertebrati, e il suo omologo in Drosophila, tolloid, sono indispensabili per lo sviluppo precoce dell’embrione, e per il processamento di specifiche componenti della ECM. Dati di letteratura relativi ad organismi modello come Hydra vulgaris chiariscono che le astacine, oltre a creare gradienti morfogenetici per garantire un corretto sviluppo dell’organismo, sono coinvolte nel rimodellamento dell’ECM. Data la crescente complessità delle interazioni che è stata evidenziata fra cellule staminali-ECM, queste proteine potrebbero perciò condizionare il comportamento anche delle cellule staminali, agendo localmente a livello del sito di taglio durante il processo di rigenerazione dei tessuti. Alcuni organismi modello come le planarie, risultano un modello ideale per lo studio delle interazioni tra la matrice extracellulare e le cellule, in particolare le cellule staminali. Le planarie sono infatti vermi piatti a vita libera (Platelminti), caratterizzate da un’elevata plasticità corporea e potenzialità rigenerativa, dovute alla presenza di una popolazione di cellule staminali pluripotenti, i neoblasti, distribuite in tutto l’organismo adulto. I neoblasti sono le uniche cellule mitoticamente attive nelle planarie adulte e qualsiasi alterazione nel loro numero e comportamento, condiziona non solo la rigenerazione, ma addirittura la sopravvivenza stessa di questi organismi. Durante il mio lavoro di tesi, partendo un’analisi in silico del genoma della planaria Schmidtea mediterranea completamente sequenziato, ho isolato sette sequenze potenzialmente codificanti astacine (Smedastacina 1- Smedastacina 7). A partire dai geni identificati e tramite l’utilizzo di programmi bionformatici (ExPASy, SMART, SignalP) sono state caratterizzate le sequenze proteiche dedotte. Queste risultano costituite da un peptide segnale, un pro-peptide e dal dominio catalitico conservato, presentando la struttura minima che caratterizza tale famiglia. Una particolarità è stata riscontrata nell’astacina 7 che porta all’estremità carbossi-terminale un dominio ShK tipico di una tossina prodotta dall’anemone di mare, e ritrovato anche in alcune metallopeptidasi di C. elegans. I geni codificanti astacine sono stati quindi amplificati e clonati, utilizzando primers specifici disegnati sul DNA genomico. Per valutare il livello di conservazione di questi geni in due specie di planaria evolutivamente distanti, questi esperimenti sono stati condotti in parallelo su due specie: S. mediterranea e Dugesia japonica. Le amplificazioni sono state condotte sia sulle sequenze genomiche che sul cDNA, allo scopo di verificare se i geni identificati siano realmente espressi. La sintesi di sonde specifiche utilizzate in esperimenti di ibridazione in situ whole mount su animali intatti e rigeneranti hanno permesso la visualizzazione dei trascritti dei singoli geni clonati. I patterns di espressione, tutti simili tra loro in entrambe le specie, coinvolgono grandi cellule secretorie, più e meno profonde, posizionate ad anello attorno al faringe. Infine, sfruttando la possibilità di applicare la tecnica dell’RNA interference (RNAi) sono stati condotti esperimenti funzionali, che dimostrano il coinvolgimento delle astacine durante la rigenerazione in planaria. L’ esperimento di RNAi condotto sull’astacina 4, in particolare, ha rivelato un’inibizione della rigenerazione degli occhi in animali rigeneranti la testa ed è inoltre emerso che gli animali, una volta tagliati, presentano gravi anomalie nella formazione del blastema rigenerativo in genere. Questo risultato dimostra che smedastacina 4 nelle planarie svolge funzioni fondamentali per l’integrità della matrice, probabilmente condizionando la corretta migrazione dei neoblasti e producendo, come conseguenza, alterazioni nella morfogenesi a livello del blastema rigenerativo