Analisi dell'espressione di geni regolati dal fattore di trascrizione Xrx1 e studio del loro ruolo funzionale

Lo sviluppo dell’occhio nei Vertebrati richiede una serie di eventi morfogenetici, quali l’iniziale specificazione della piastra neurale anteriore in “eye field”, la successiva evaginazione bilaterale delle vesicole ottiche e, infine, la determinazione dei diversi strati retinici e del cristallino. Gli eventi che portano alla formazione delle strutture oculari richiedono una serie di fattori implicati nel controllo del ciclo cellulare e nel differenziamento chiamati fattori di trascrizione del campo dell’occhio (EFTFs). Fra questi un ruolo cruciale è svolto dal fattore di trascrizione Rx1 contenente un dominio “homeobox” di tipo “paired-like”. Nell’organismo modello Xenopus laevis, Xrx1 è espresso inizialmente, allo stadio di neurula precoce, nella regione proliferativa della piastra neurale anteriore, successivamente la sua espressione si localizza nelle vescicole ottiche e, a stadio di larva natante, nelle coppe ottiche, nel diencefalo ventrale e nella ghiandola pineale. Al termine del differenziamento retinico la sua espressione si localizza nei fotorecettori, in alcune cellule dello strato nucleare interno e nella regione proliferativa del margine ciliare (CMZ), dove è implicato nel mantenimento della staminalità dei progenitori retinici che permettono la rigenerazione durante tutta la vita dell’animale. Nell’ambito dello studio dei geni regolati da questo fattore di trascrizione sono stati condotti esperimenti di aumento o diminuzione sperimentale dell’espressione di Xrx1 a stadio di neurula precoce e, utilizzando “microarray” commerciali “Genechip Xenopus laevis genome array” sono stati valutati i trascritti che aumentavano o diminuivano la loro espressione in seguito a queste variazioni. Tra questi sono stati selezionati 51 geni che mostravano un andamento “coerente” ossia che aumentavano o diminuivano la loro espressione durante l’attivazione funzionale di Xrx1 e si comportavano in maniera opposta a seguito della perdita di funzione. Lo scopo del mio progetto di tesi è quello di caratterizzare il profilo di espressione e di validare i dati dei “microarrays” per alcuni di questi geni ricercando anche una possibile connessione funzionale con rx1 I primi ad essere stati analizzati sono dei geni ben noti per il loro coinvolgimento nello sviluppo e differenziamento muscolare. Tra questi il gene principale oggetto del mio studio è stato MyoD su cui ho condotto ibridazioni in situ su embrioni interi a stadi precoci di sviluppo e ibridazioni in situ su sezioni di retina completamente differenziata. L’espressione all’interno della retina è stata poi ricercata conducendo ibridazioni in situ su espianti oculari di vario genere. Al fine di aumentare ulteriormente la sensibilità dell’analisi, ho condotto RT-PCR ed infine Real Time PCR, che ho utilizzato anche per ricercare una eventuale relazione funzionale tra Rx1 e MyoD paragonando l’intensità dell’espressione di MyoD tra embrioni di controllo ed embrioni sovraesprimenti Rx1. Gli stessi esperimenti di RT-PCR e Real Time PCR sono state effettuati per gli altri geni del differenziamento muscolare: Mastr, e Pri-mir133/1. Le ibridazioni in situ non mostrano espressione del gene MyoD all’interno dell’occhio, seppure in letteratura sia riportata l’espressione del gene nella retina di pollo e di un topo transgenico. Risultato positivo viene invece da Real Time PCR che mostrano espressione del gene in espianti di retina e documentano un aumento dei suoi livelli a stadio di neurula precoce a seguito della sovraespressione di Rx1. Nella seconda parte della tesi mi sono occupato di studi di espressione e funzionali di un altro gene “coerente”: jhdm1D. Questo gene fa parte di una famiglia di istone demetilasi, enzimi coinvolti nel rimodellamento della cromatina e quindi nel controllo dell’espressione genica