COSTRUZIONE DI UN SISTEMA SILENZIANTE LA cN-II IN MODO INDUCIBILE

La cN-II (5’-nucleotidasi citosolica di tipo II) è una proteina citosolica, ubiquitaria nei tessuti umani, appartenente alla famiglia delle 5’-nucleotidasi. Questa famiglia comprende sette proteine, una è una proteina transmembrana, altre cinque hanno localizzazione citosolica ed una è presente nella matrice mitocondriale. Questi enzimi sono in grado di defosforilare i ribonucleosidi e desossiribonucleosidi non ciclici 5’-monofosfato, liberando il nucleoside corrispondente e fosfato inorganico. La cN-II è attiva nei confronti dei nucleosidi 6-ossipurinici 5’ monofosfato (IMP, dIMP, GMP, dGMP, XMP), che vengono idrolizzati al corrispondente nucleoside, con la formazione di un intermedio covalente fosfo-enzimatico. Il fosfato può essere ceduto per attacco nucleofilo ad una molecola d’acqua, oppure ad un altro accettore nucleofilo. A differenza di altre nucleotidasi infatti, la cN-II può agire anche come fosfotransferasi, cedendo il fosfato preferenzialmente a inosina, guanosina o deossiinosina (Ipata e Tozzi, 2006). Il meccanismo catalitico, così come la struttura di questo dominio, sono caratteristici della superfamiglia delle aloacido dealogenasi (HAD), cui l’enzima appartiene (Allegrini et al., 2004). La regolazione dell’attività enzimatica è complessa e dipendente dalla carica energetica della cellula. ATP, ADP, BPG (2,3-bisfosfoglicerato), Ap4A (diadenosina tetrafosfato), polifosfati e alte concentrazioni di KCl attivano l’enzima, mentre il Pi è l’unico inibitore noto; l’enzima necessita poi di Mg2+ e ha la massima attività in un ambiente riducente (Pesi et al., 1996; Pesi et al., 1998). La cN-II è attiva anche nei confronti di analoghi di nucleosidi e nucleotidi utilizzati in terapia antivirale ed antitumorale, quali ed esempio 2’3’-didesossiinosina, acyclovir, ribavirina, fludarabina; una piena comprensione dell’attività e della struttura di questo enzima potrà quindi contribuire alla buona riuscita di terapie su essi basate (Hunsuker et al., 2005). Alterazioni dell’attività della cN-II sono state misurate in pazienti affetti dalla sindrome di Lesh-Nyhan (Pesi et al., 2000), un grave disturbo neurologico e comportamentale, mentre è controverso il ruolo dell’enzima nelle neoplasie ematologiche. Diversi autori mostrano come elevati livelli di mRNA della cN-II in pazienti adulti affetti da leucemia mieloide acuta e trattati con citarabina siano un marker statisticamente significativo di un peggior successo terapico. Dal momento che la cN-II non è attiva nei confronti della citarabina, che pure è un analogo dei nucleotidi purinici, l’ipotesi più recente indica che il livello di mRNA della cN-II rifletta lo stato proliferativo delle cellule e sia quindi un marker di una forma più severa della patologia (Galmarini et al., 2005). Vi sono, e sono tuttora in corso, numerosi studi volti a capire quale sia il ruolo fisiologico della proteina. In base alla caratteristiche cinetiche e regolatorie dell’enzima è stato ipotizzato che il ruolo della cN-II sia l’idrolisi dell’eccesso di IMP (derivante da vie di sintesi de novo o di recupero) in condizioni di elevata carica energetica; in condizioni ischemiche invece l’attività dell’enzima decresce, prevenendo così la perdita di nucleotidi purinici. L’enzima potrebbe poi partecipare alla regolazione dei pools intracellulari di nucleotidi purinici (IMP e GMP) e di fosforibosilpirofosfato attraverso il ciclo delle ossipurine. Secondo le conoscenze attuali la cN-II è l’unico enzima in grado di fosforilare inosina e guanosina, che non sono substrato di nessuna chinasi cellulare (Ipata and Tozzi, 2006; Barsotti et al., 2004). L’attività della cN-II sembra essere fondamentale per le cellule umane; infatti studi di silenziamento della cN-II con tecniche di RNAi mostrano che le cellule in cui la cN-II viene silenziata muoiono per apoptosi (Careddu et al., 2008). Studi molto preliminari su un altro modello eucariotico (S. cerevisiae) sembrano suggerire che la cN-II sia fondamentale per la vitalità delle cellule, regolando i pools di nucleotidi. Questo lavoro di tesi si inserisce in un progetto più ampio, sulla scia dei risultati di Careddu e colleghi, volto a silenziare la cN-II in modo inducibile in cellule di astrocitoma umano (ADF). Questo lavoro mira a comprendere l’importanza della cN-II nelle vie di sintesi e di recupero dei nucleotidi, nonché il ruolo fisiologico della proteina. Il sistema scelto è un vettore lentivirale, in grado di aumentare la versatilità del sistema garantendo un maggiore spettro d’ospite. Questo vettore, portante lo short harpin di interesse, verrà prodotto nella linea cellulare umana HEK 293T, e verrà utilizzato per infettare le cellule bersaglio (ADF) su cui verranno poi studiati gli effetti del silenziamento. Questa tesi si riferisce ai primi passi di questo progetto, ossia la costruzione del sistema di silenziamento inducibile. Per arrivare a questo risultato, la sequenza in grado di silenziare la cN-II, ossia lo sh661 (Careddu et al., 2008), è stata clonata nel vettore pLVTHM, in grado di dare un silenziamento costituitivo. Da questo, lo sh661 è stato clonato nel vettore pLVCT-tTR-KRAB, per il sistema di silenziamento condizionale, a valle dell’operatore della tetraciclina. Questo vettore infatti codifica per una proteina di fusione tra il repressore dell’operatore della tetraciclina ed il dominio KRAB (Krüppel associated box), in grado di guidare il silenziamento tramite la formazione di eterocromatina fino ad una distanza di 3kb dal sito di legame. Il repressore è in grado di legarsi all’operatore in assenza, ma non in presenza, di doxyciclina, pertanto l’aggiunta di questo antibiotico porta al distacco della proteina di fusione e quindi all’espressione dello short harpin. Il plasmide presenta poi il gene per la GFP, la cui espressione è regolata dallo stesso operatore che regola l’espressione dello sh661, ed ha permesso quindi di verificare l’inducibilità del sistema