Valutazione della contaminazione virale in matrici alimentari con particolare attenzione ai vegetali a foglia larga

Gli alimenti possono essere veicolo di vari agenti patogeni di natura batterica, protozoaria e virale che provocano l'insorgenza nell'uomo di diverse patologie e, nonostante i progressi fatti nel settore della prevenzione, rappresentano ancora un serio problema di sanità pubblica. Tra gli agenti virali, particolare interesse rivestono i membri appartenenti alle famiglie Caliciviridae (Norovirus e Sapovirus). Negli ultimi anni sono stati riportati diversi episodi epidemici causati da virus enterici ed in particolare da Norovirus umani legati al consumo di alimenti. Tale virus rappresenta una delle più comuni cause di gastroenteriti non batteriche nell’uomo. Oltre all'acqua, gli alimenti maggiormente coinvolti si identificano specialmente nei prodotti della pesca (molluschi) e nei vegetali consumati crudi, fra cui predominano frutti di bosco ed insalata. Infatti tali matrici alimentari possono essere contaminate direttamente con acque reflue o indirettamente da suoli contaminati da queste. L’insalata, per il suo diffuso utilizzo anche in confezioni pronte all’uso (cosiddetta IV gamma) rappresenta un veicolo sempre più temuto di infezioni da virus enterici ed in particolare da Norovirus. Nell’ ambito dei controlli microbiologici inseriti nelle procedure dell’HACCP per la produzione di tali confezioni, i virus non sono stati finora considerati per le difficoltà tecniche connesse con la loro rilevazione e l’assenza di protocolli analitici standardizzati. Si può quindi ritenere che lo sviluppo e la validazione di metodi per la rilevazione e la quantificazione dei Norovirus in matrici vegetali rappresenti ormai una necessità ai fini dell’autocontrollo. Lo scopo quindi della tesi è la valutazione del rischio virale in matrici alimentari con particolare riferimento ai vegetali a foglia larga (insalata). Tale obiettivo è stato incentrato su due fasi: una prima fase di messa a punto di una tecnica per la rilevazione molecolare di virus enterici (Norovirus) in matrici alimentari vegetali e una seconda fase di sperimentazione direttamente su piantine d’insalata irrigate con acqua contaminata artificialmente. Durante la messa a punto della tecnica, dopo un’attenta ricerca bibliografica sono state individuate tre principali fasi all’interno del protocollo di ricerca: fase di contaminazione, fase di eluizione e fase di concentrazione. Nella prima fase si è proceduto a prove di contaminazione artificiale della matrice di insalata ossia addizionare aliquote di Norovirus al campione da analizzare. Nella seconda fase, i campioni contaminati artificialmente sono stati sottoposti a fase d’eluizione con aggiunta di eluente. Per questa fase sono stati testati due tipi di eluenti: TGBE(Tris 1000mM,Glicina 50mM,Beef Extract 1%pH9,5) e Glicina pH8,5 che sono risultati gli eluenti più usati e efficienti in studi recenti. Il virus, che si trova a questo punto in sospensione, viene recuperato attraverso tecnica di centrifugazione e tecnica di filtrazione con particolari membrane per eliminare il particolato di origine alimentare. Nella terza fase l’eluato è stato concentrato tramite PEG 6000. Ad ogni step del protocollo è stata prelevata un’aliquota da sottoporre ad analisi biomolecolari per individuare eventuale fase discriminante e successivamente sottoposta ad analisi di estrazione di genoma virale tramite kit commerciale Qiagen. Al fine di avere una valutazione di percentuale di recupero virale, abbiamo sottoposto gli estratti ad analisi quantitativa tramite la Real Time PCR (protocollo Argene Norovirus). Successivamente tale protocollo di ricerca virale è stato comparato con il protocollo CEN (CEN/TC275/WG6/TAG4) per la rilevazione di Norovirus in matrici alimentari al fine di individuare l’efficacia maggiore fra i due protocolli. Una volta scelto il protocollo di ricerca virale migliore, nella fase di sperimentazione sono state sottoposte ad analisi foglie di piantine d’insalata sub-irrigate con acqua contaminata con Norovirus a titolo noto a diverse concentrazioni per valutare l’eventuale assorbimento virale della pianta attraverso la radice con scansione di tempi diversi