PREPARAZIONE E CARATTERIZZAZIONE CHIMICO-FISICA E BIOLOGICA DI SUPPORTI BIOCOMPATIBILI PER APPLICAZIONI DI INGEGNERIA TISSUTALE

Corso di Laurea in Scienze e Tecnologie Biomolecolari Candidata: Chiara Migone (253407) (3398625641-0586580230 ) Relatore: Dr.ssa Federica Chiellini (050-2210305) Sede: Laboratorio di Materiali Polimerici Bioattivi per Applicazioni Biomediche ed Ambientali (BIOlab) – Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale – Universita’ di Pisa “Preparazione e Caratterizzazione chimico-fisica e biologica di supporti biocompatibili per applicazioni di ingegneria tissutale” L’ingegneria dei tessuti è un campo di ricerca emergente che offre notevoli opportunità per la medicina rigenerativa. L’ingegneria tissutale mira alla riparazione o sostituzione di tessuti e/organi mediante l’utilizzo di cellule associato a componenti extracellulari (scaffolds), naturali o sintetici, per lo sviluppo di sistemi impiantabili. Il presente lavoro di tesi è stato incentrato sulla preparazione e caratterizzazione chimico-fisica e biologica di scaffolds polimerici ottenuti tramite la tecnica di filatura ad umido (wet spinning), una tra le tecniche più studiate per la produzione di supporti polimerici fibrosi. Brevemente, una soluzione polimerica viene estrusa da una siringa in una soluzione coagulante di etanolo (non solvente per il materiale polimerico) per mezzo di una pompa. Il polimero scelto per la preparazione dei supporti è un poliestere biocompatibile e biodegradabile denominato poli(ε-caprolattone) con struttura macromolecolare a stella (*PCL 189 ) con peso molecolare (PM) di 189000. La produzione mediante wet spinning è stata ottimizzata studiando la concentrazione del polimero nella soluzione, la composizione del bagno di coagulazione e il flusso di alimentazione della soluzione. Inoltre è stato effettuato il caricamento nelle fibre di enrofloxacina o levofloxacina, due fluorochinoloni con attività antibiotica, mediante estrusione di una soluzione polimero/antibiotico. L’analisi SEM ha evidenziato che gli scaffolds tridimensionali prodotti sono composti da fibre di diametro dell’ordine di poche centinaia di micrometri. Il caricamento effettivo degli antibiotici nelle fibre di *PCL189 e la cinetica di rilascio degli antibiotici sono stati studiati tramite tecnica HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione, high performance liquid chromatography). Per il caricamento si è proceduto alla quantificazione dell’agente attivo nel bagno di coagulazione e nelle fibre polimeriche. Il caricamento effettivo è risultato circa il 70 % dell’antibiotico totale caricato. La cinetica di rilascio dei farmaci è stata studiata in vitro mediante immersione in PBS (soluzione di tampone fosfato) a 37°C, sotto agitazione, per circa 50 giorni. Per calcolare il rilascio dell’antibiotico in termini cumulativi, sono stati prelevati dei campioni a vari intervalli di tempo e analizzati mediante HPLC. Gli scaffold hanno mostrato un rilascio controllato rapido nei primi giorni, evidenziando il cosiddetto effetto burst, per poi mantenersi costante nei giorni successivi. Gli scaffolds preparati sono stati inoltre sottoposti ad una accurata valutazione in vitro della citotossicità sulla linea cellulare di preosteoblasti murini MC3T3-E1 ( ATCC CRL-2593 ) mediante il saggio di sali di tetrazolio (WST-1), caratterizzati da un punto di vista morfologico con microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Corso di Laurea in Scienze e Tecnologie Biomolecolari Candidata: Chiara Migone (253407) (3398625641-0586580230 ) Relatore: Dr.ssa Federica Chiellini (050-2210305) Sede: Laboratorio di Materiali Polimerici Bioattivi per Applicazioni Biomediche ed Ambientali (BIOlab) – Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale – Universita’ di Pisa “Preparazione e Caratterizzazione chimico-fisica e biologica di supporti biocompatibili per applicazioni di ingegneria tissutale” L’ingegneria dei tessuti è un campo di ricerca emergente che offre notevoli opportunità per la medicina rigenerativa. L’ingegneria tissutale mira alla riparazione o sostituzione di tessuti e/organi mediante l’utilizzo di cellule associato a componenti extracellulari (scaffolds), naturali o sintetici, per lo sviluppo di sistemi impiantabili. Il presente lavoro di tesi è stato incentrato sulla preparazione e caratterizzazione chimico-fisica e biologica di scaffolds polimerici ottenuti tramite la tecnica di filatura ad umido (wet spinning), una tra le tecniche più studiate per la produzione di supporti polimerici fibrosi. Brevemente, una soluzione polimerica viene estrusa da una siringa in una soluzione coagulante di etanolo (non solvente per il materiale polimerico) per mezzo di una pompa. Il polimero scelto per la preparazione dei supporti è un poliestere biocompatibile e biodegradabile denominato poli(ε-caprolattone) con struttura macromolecolare a stella (*PCL 189 ) con peso molecolare (PM) di 189000. La produzione mediante wet spinning è stata ottimizzata studiando la concentrazione del polimero nella soluzione, la composizione del bagno di coagulazione e il flusso di alimentazione della soluzione. Inoltre è stato effettuato il caricamento nelle fibre di enrofloxacina o levofloxacina, due fluorochinoloni con attività antibiotica, mediante estrusione di una soluzione polimero/antibiotico. L’analisi SEM ha evidenziato che gli scaffolds tridimensionali prodotti sono composti da fibre di diametro dell’ordine di poche centinaia di micrometri. Il caricamento effettivo degli antibiotici nelle fibre di *PCL189 e la cinetica di rilascio degli antibiotici sono stati studiati tramite tecnica HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione, high performance liquid chromatography). Per il caricamento si è proceduto alla quantificazione dell’agente attivo nel bagno di coagulazione e nelle fibre polimeriche. Il caricamento effettivo è risultato circa il 70 % dell’antibiotico totale caricato. La cinetica di rilascio dei farmaci è stata studiata in vitro mediante immersione in PBS (soluzione di tampone fosfato) a 37°C, sotto agitazione, per circa 50 giorni. Per calcolare il rilascio dell’antibiotico in termini cumulativi, sono stati prelevati dei campioni a vari intervalli di tempo e analizzati mediante HPLC. Gli scaffold hanno mostrato un rilascio controllato rapido nei primi giorni, evidenziando il cosiddetto effetto burst, per poi mantenersi costante nei giorni successivi. Gli scaffolds preparati sono stati inoltre sottoposti ad una accurata valutazione in vitro della citotossicità sulla linea cellulare di preosteoblasti murini MC3T3-E1 ( ATCC CRL-2593 ) mediante il saggio di sali di tetrazolio (WST-1), caratterizzati da un punto di vista morfologico con microscopia confocale a scansione laser (CLSM)