Effetti del trapianto di cellule staminali mesenchimali sulle alterazioni del microcircolo piale del ratto dopo occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media

L’occlusione dell’arteria cerebrale media (MCAO) induce la formazione di tre zone che possono essere classificate in base all’apporto ematico: il core ischemico non perfuso, la zona di penombra con ridotto flusso e la zona più periferica normalmente irrorata. Lo studio dell’area di penombra ha sempre destato molto interesse in quanto la riduzione del flusso sanguigno non è così marcata da causare una perdita irreversibile del metabolismo energetico e necrosi cellulare. Pertanto durante la riperfusione, la penombra definita metaforicamente “la bella addormentata” può manifestare una potenziale capacità di ripresa dell’attività neuronale. Le terapie attualmente impiegate nella pratica clinica per la cura dell’ictus limitano i danni da non reflusso nella fase acuta ma a lungo termine non risultano efficaci nel risolvere i deficit neurologici. Pertanto la ricerca di nuove terapie per la risoluzione del danno ischemico è ancora argomento di controversie e di notevole interesse scientifico. Al momento quelle più promettenti sembrano essere le terapie cellulari. Il presente progetto di ricerca ha come obiettivo quello di valutare in vivo quantitativamente e qualitativamente gli effetti delle cellule staminali mesenchimali (MSCs) sulle alterazioni vascolari a breve e lungo termine che si verificano in seguito all’occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media. Per questo studio è stato messo a punto un modello sperimentale animale che permette la visualizzazione diretta del microcircolo cerebrale piale sia in fase acuta che a differenti tempi di riperfusione. Tale metodica consente di valutare l’organizzazione del network piale e le alterazioni vascolari indice di danno. Lo studio sperimentale è stato condotto su ratti Wistar maschi del peso di 250-300 g nei quali è stata eseguita sotto anestesia l’occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media mediante inserzione di un nanofilamento ricoperto di silicone. È stata preparata una finestra cranica aperta a livello della corteccia parietale per esporre il network microvascolare piale. L’osservazione del microcircolo è stata condotta con una metodica di microscopia in fluorescenza utilizzando come tracciante l’isotiocianato di fluoresceina legato al destrano (70kDa). Le arteriole sono state classificate secondo una metodica centripeta (metodo di Strahler, modificato secondo il diametro). Il danno vascolare è stato quantificato attraverso l’analisi computerizzata di 4 parametri: formazione dell’edema, adesione leucocitaria, perfusione capillare e vasomotilità arteriolare. Il trattamento cellulare è consistito nell’infusione intracarotidea di cellule staminali mesenchimali precedentemente caratterizzate fenotipicamente. Infine gli animali utilizzati sono stati sottoposti a test comportamentali per verificare le funzioni motorie e sensoriali. In condizioni fisiologiche il network microvascolare piale è organizzato in 5 ordini di vasi arteriolari. Ai capillari è stato assegnato ordine 0, alle arteriole da cui originano i capillari è stato assegnato ordine 1 e ordini progressivamente maggiori fino ad arrivare alle arteriole più grandi del preparato (ordine 5). La distribuzione dei diametri, delle lunghezze e delle ramificazioni dei diversi ordini di vasi risponde alla legge di Horton. Questo andamento viene descritto dal rapporto segmenti/elementi che quando assume valore di 1 indica simmetria di biforcazione mentre valori superiori ad 1 indicano asimmetria. I vasi di ordine maggiore risultano più asimmetrici. Tale asimmetria è descritta in dettaglio dalla matrice di connettività. Nessuna alterazione microvascolare è stata rilevata durante l’intero periodo di osservazione (60 min). L’occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media e la successiva riperfusione (1h) determina una marcata alterazione dell’organizzazione geometrica del network microvascolare ed importanti danni microvascolari come aumentata permeabilità, numerosi leucociti adesi alle pareti venulari, una ridotta perfusione capillare ed un’alterata funzionalità arteriolare. A vari tempi di riperfusione (7, 14, 28 giorni) le arteriole piali si riorganizzano geometricamente in arteriole anastomotiche fino a raggiungere un modello vascolare simile a quello osservato in condizioni fisiologiche. I danni vascolari si attenuano con il prolungare della riperfusione anche se persiste una pronunciata permeabilità vascolare, un’elevata adesione leucocitaria e una ridotta perfusione capillare. Inoltre l’attività di vasomotilità è risultata leggermente inferiore a quella osservata nei basali così come la risposta all’Acetilcolina e Papaverina. Il trattamento con le cellule staminali mesenchimali dopo l’occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media e successiva riperfusione induce una riorganizzazione in tempi più brevi del network microvascolare. Le arteriole ai diversi tempi di riperfusione si riorganizzano in vasi anastomotici che attraversano l’intera regione ischemica mantenendo le caratteristiche geometriche osservate nel basale. I danni microvascolari sono meno rilevanti in tutte le fasi della riperfusione, le arteriole rispondono dilatandosi alla somministrazione di Acetilcolina e Papaverina e dopo 28 giorni riacquistano le stesse frequenze di vasomotilità proprie delle condizioni fisiologiche. I test comportamentali eseguiti ai diversi tempi di riperfusione hanno evidenziato che i ratti trattati con MSCs mostrano una ripresa in tempi più brevi della funzionalità motoria e sensoriale se confrontati con gli animali non trattati. Concludendo la somministrazione di cellule staminali mesenchimali induce una più rapida riorganizzazione del network microvascolare secondo una distribuzione frattale come osservata nel basale; inoltre le arteriole si riorganizzazione in vasi anastomotici e quelle più piccole (ordine 1 e 2) emettono numerosi vasi che penetrano nello strato corticale. E’ possibile ipotizzare che le MSCs siano in grado di indurre angiogenesi tramite l’espressione di fattori di crescita e citochine quali BDNF, NGF, VEGF. Tale attività è finalizzata a ripristinare un adeguato apporto ematico sia nella zona di penombra che in quella ischemica in modo da permettere una normale attività neuronale. La terapia cellulare potrà essere una promettente alternativa e avere un impatto drastico nella terapia acuta dell'ictus cerebrale limitando la disabilità permanente