Analisi morfologica, funzionale e fisiopatologica delle inclusioni ottenute in cellule PC12 mediante trattamento con metanfetamina

La presenza di inclusioni neuronali è una caratteristica anatomopatologica di un ampio numero di malattie neurodegenerative come la Malattia di Parkinson (MdP). Questi inclusi, noti anche come corpi di Lewy, sono stati descritti come aggregati citoplasmatici neuronali eosinofili che si possono distinguere in base alla sede di localizzazione ed alle caratteristiche strutturali in una forma classica ed una corticale. I classici corpi di Lewy sono localizzati a livello del tronco encefalico e del proencefalo e presentano un core denso circondato da un alone pallido. Gli inclusi corticali sono presenti nel telencefalo, presentano un aspetto uniforme senza differenza tra le regioni esterne e quelle centrali e sono debolmente eosinofili. Attualmente alcune ricerche propongono che le due forme siano in realtà stadi di diversa maturazione e che i corticali siano la forma più immatura che naturalmente evolve verso la forma classica con il progredire del danno cellulare. Queste ipotesi sono fondate sullo studio dei meccanismi di formazione delle inclusioni neuronali che chiamano in causa il sistema ubiquitina-proteasoma (UP), una delle principali vie per la degradazione di proteine anomale, mutate od eccessivamente espresse. Il mancato funzionamento del sistema UP anche in maniera parziale è in grado di determinare un accumulo di proteine nel citosol cellulare che, aggregandosi, formano le inclusioni o corpi di Lewy. La presenza di proteine appartenenti al sistema UP ed enzimi associati allo stesso, all’interno degli inclusi neuronali conferma il ruolo chiave di questo sistema, come evidenziato anche in studi post-mortem. Gli studi condotti dal nostro gruppo su modelli animali trattati con metanfetamina (MA) hanno permesso di osservare la formazione di inclusioni neuronali citoplasmatiche a livello della substantia nigra. Al fine di indagare questo fenomeno in maniera più approfondita abbiamo condotto una serie di ricerche su modelli in vitro. La prima parte del progetto ha previsto una serie di esperimenti pilota che hanno permesso di individuare la dose di MA e il tempo d’esposizione ottimali ottenendo la maggior quantità di cellule con inclusi e il maggior numero di inclusi per cellula. Gli studi condotti successivamente hanno confermato una correlazione tempo dipendente nel numero degli inclusi e nella loro ultrastruttura. Questo dato ha permesso di stabilire una progressione nell’evoluzione della formazione dell’incluso che passa da un aspetto multimembranale concentrico ad una fase intermedia, in cui si osserva una progressiva fusione delle membrane in senso centrifugo, fino a perdere la conformazione membranosa del core, ottenendo un aspetto analogo ai corpi di Lewy.Questo dato conferma l’evoluzione dinamica degli inclusi che sono soggetti a modificazioni sia morfologiche strutturali.La seconda parte ha permesso di confermare, anche in vitro, la positività per antigeni specifici dei corpi di Lewy, come α-sinucleina e ubiquitina. Questo è stato effettuato su diversi stadi di maturazione dell’incluso, dopo frazionamento per mezzo di centrifugazione differenziale. Infine sono stati effettuati studi di immunoblotting per valutare la presenza ed una eventuale variazione di espressione dell’ubiquitina e dell’α-sinucleina nelle varie frazioni. Questo ampio progetto di ricerca ha confermato quindi che la MA induce la formazione di inclusioni citoplasmatiche in cellule PC12 in maniera dose e tempodipendente. Inoltre le formazioni ottenute presentano una immunopositività per i markers osservati negli inclusi presenti nelle malattie neurodegenerative e ne indicano una evoluzione morfologica e strutturale, indicando che sono prodotte da un meccanismo patogenetico comune in cui è coinvolta l’attività del sistema UP