Identificazione di geni codificanti proteine di tipo rodopsinico nelle alghe

In questo lavoro sono state utilizzate tecniche di biologia molecolare per verificare la presenza di geni codificanti proteine di tipo rodopsinico in alghe unicellulari. Queste proteine, come è noto, permettono la visione nell’uomo e sono largamente distribuite in tutti i domini del vivente (Archaea, Bacteria, Eukarya) con funzioni analoghe. Per la ricerca di sequenze codificanti proteine di tipo rodopsinico, sono state utilizzate colture algali appartenenti a diverse divisioni. È stato costruito un database utilizzando 104 sequenze di proteine omologhe disponibili in letteratura, disegnando i primers, da utilizzare nelle successive reazioni di Polymerase Chain Reaction (PCR), sulla base di allineamenti multipli provenienti da tale database. Le proteine di tipo rodopsinico, pur presentando una conservazione aminoacidica ben riconoscibile e patterns aminoacidici peculiari nella terza, sesta e settima elica, hanno una percentuale di identità (27-40%) insufficiente a localizzare regioni abbastanza estese di aminoacidi identici su cui basarsi per individuare i primers. Per ovviare a questo inconveniente, si sono disegnati un numero molto elevato di primers degenerati individuati nelle regioni conservate, verificando poi in ogni organismo algale, tramite PCR, il risultato di circa ottanta possibili accoppiamenti di tali primers, per un totale di circa settecento esperimenti. Come templato per le reazioni di PCR è stato utilizzato il cDNA, in modo da evitare la presenza di regioni non codificanti. Sono stati clonati e sequenziati tutti i prodotti di PCR che all’analisi elettroforetica hanno prodotto bande specifiche e di peso corrispondente a quello teorico. L’analisi informatica delle sequenze ottenute ha prodotto previsioni di eliche transmembranali in due casi, nei quali si è proceduto con le 5’/3’ RACEs (Rapid Amplification of cDNA Ends), relativo clonaggio e sequenziamento. Queste sequenze sono trascritti genici codificanti proteine di tipo rodopsinico di due alghe unicellulari, Cyanophora paradoxa (Glaucophyta), e Pavlova lutheri (Haptophyta); corrispondono a proteine transmembranali di tipo rodopsinico a sette eliche di membrana con l’aminoacido Lisina presente a metà della settima elica. Quando paragonate alle proteine di tipo rodopsinico presenti nei più comuni database, queste sequenze hanno evidenziato una somiglianza aminoacidica estremamente elevata (e-value = e-30 ). Queste due sequenze si vanno così ad aggiungere a quelle già note in letteratura per altre sei alghe