De-regolazione della trascrizione genica in pazienti affetti dalla sindrome di Cornelia de Lange

Riassunto Titolo: “De-regolazione della trascrizione genica in pazienti affetti dalla sindrome di Cornelia de Lange” La sindrome di Cornelia de Lange (CdLS) è un disordine multisistemico geneticamente eterogeneo. L’incidenza della malattia è stata stimata essere di circa 1 nuovo caso ogni 10000 nati. Il fenotipo dei soggetti affetti è variabile, ma presenta alcuni tratti facilmente riconoscibili: gli individui mostrano una lenta crescita pre- e post- natale, vari gradi di deficit dello sviluppo e di ritardo mentale. Gli organi tipicamente coinvolti sono le strutture cranio-facciali, gli arti superiori, gli occhi e il sistema gastrointestinale. I soggetti mostrano caratteristiche facciali tipiche: le sopracciglia sono sottili, arcuate e frequentemente unite sulla linea mediana, le ciglia sono lunghe, il naso è piccolo con le narici rivolte verso l’alto, le labbra sono sottili con gli angoli rivolti verso il basso. Gli arti sono coinvolti a vari livelli di gravità: nei casi più gravi si ha completa assenza dell’avanbraccio, mentre nei casi più lievi si notano mani piccole con clinodattilia. La maggior parte dei casi sono sporadici e dominanti. In circa il 60% dei soggetti è stata trovata una mutazione a carico del gene Nipped-B-Like (NIPBL), il quale mappa sul cromosoma 5. Studi di correlazione genotipo-fenotipo indicano che mutazioni più gravi del gene (come delezioni o mutazioni nonsenso) causano forme più gravi di malattia rispetto a quelle causate da mutazioni missenso. La proteina codificata da NIPBL è richiesta per il legame del complesso della coesina alla cromatina. La coesina è un eterotetramero composto da SMC1A, SMC3, le quali appartengono alla famiglia SMC (Structural Maintenance of Chromosome), RAD21 e SA. Il complesso della coesina ha la funzione di mantenere uniti i cromatidi fratelli durante il ciclo cellulare fino alla loro separazione nelle due cellule figlie. Le proteine SMC1A, SMC3 e RAD21 formano una struttura ad anello, la quale media la coesione circondando i due cromatidi fratelli. Il complesso della coesina si associa inoltre con proteine accessorie che contribuiscono ad aprire e chiudere l’anello o a stabilizzarne la struttura. Esempi di queste proteine sono, oltre a NIPBL, WAPLl, PDS5A, PDS5B, ESCO1 ed ESCO2. Lo screening di pazienti CdLS negativi per mutazioni in NIPBL ha rivelato che il gene SMC1A è responsabile di un ulteriore 5% dei casi. Le mutazioni sono tutte missenso o piccole delezioni in frame. È stato, inoltre, individuato un soggetto con una delezione in frame di 3 bp nel gene SMC3. Recenti studi suggeriscono che la coesina, oltre al suo ruolo canonico, gioca un ruolo anche nella regolazione dell’espressione genica. Infatti, studi in Drosophila hanno dimostrato che la coesina regola la trascrizione dei geni Cut e Ultrabithorax. Inoltre, studi “genome wide” hanno mostrato che la coesina colocalizza con il CTCF, una proteina coinvolta nella regolazione della trascrizione. CTCF è un isolatore, blocca, cioè, l’interazione tra promotore ed enhancer. Queste evidenze sperimentali suggeriscono che le basi molecolari della CdLS possano risiedere in alterazioni nel processo di trascrizione genica. La tesi ha l’obiettivo di studiare lo stato della trascrizione genica in pazienti CdLS che presentano mutazioni nei geni SMC1A e SMC3. A questo scopo, linee linfoblastoidi di pazienti CdLS sono state dapprima caratterizzate mediante sequenziamento dei geni SMC1A e SMC3 al fine di identificarne le mutazioni. Successivamente è stata condotta un’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con anticorpi che riconoscono proteine dell’apparato trascrizionale. Per verificare lo stato generale della trascrizione sono stati scelti due geni costitutivamente espressi, DHFR (Diidrofolato reduttasi) e GADPH (Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi), i quali sono stati amplificati nei pazienti e nei controlli utilizzando la tecnica della Real Time PCR. I risultati mostrano che la trascrizione genica è deregolata nei pazienti CdLS, rafforzando ulteriormente l’ipotesi che il fenotipo CdLS sia dovuto a difetti della trascrizione genica