Analisi proteomica nel cervello di ratti sottoposti ad apprendimento

Questa tesi sperimentale fa parte di un progetto di ricerca basato sullo studio dei meccanismi di apprendimento e memoria a lungo termine in seguito a condizionamento contestuale alla paura nel ratto. Nel condizionamento classico alla paura, o “classical fear conditioning”, è noto che l'attivazione di gran parte dell'amigdala in seguito a uno stimolo di paura determina un tipo di risposta comportamentale. Nel condizionamento contestuale alla paura, o “contextual fear conditioning” (CFC), oltre all'amigdala si ha l'attivazione dell'ippocampo, cosicché la risposta non è condizionata solo dallo stimolo di paura ma anche dall'ambiente in cui esso viene presentato. Una volta sottoposti al CFC infatti, gli animali mostrano la tipica risposta di “freezing” se riposizionati nell'apparato di condizionamento, retrieval test. Tale risposta comportamentale è osservabile fino a 28 giorni successivi all'addestramento. Registrazioni elettrofisiologiche effettuate su “slices” di ippocampo di ratti condizionati hanno inoltre evidenziato un aumento dell'eccitabilità nello strato CA1 fino a 7 giorni dall'addestramento. Queste evidenze sperimentali durature nel tempo hanno suggerito l’ipotesi di una diversa espressione genica nel sistema nervoso di ratti condizionati rispetto a quello di controlli non condizionati (naïve), traducibile in una sintesi differenziale di mRNA e proteine. Per individuare i geni espressi differenzialmente è stata usata la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (Suppression Subtractive Hybridisation, SSH) che permette di isolare anche trascritti rari o poco espressi non evidenziabili con altre tecniche. Partendo dal mRNA poliA+ estratto dalle regioni medio-temporali del cervello di ratti naïve e condizionati sono state costruite le librerie sottrattive forward e reverse di cDNA. Una volta valutata l’efficienza della sottrazione, le sequenze di cDNA sono state clonate e sottoposte a screening. Le sequenze dei cloni differenziali sono state comparate con quelle depositate in banche dati utilizzando software come FASTA e BLAST. L’analisi di espressione dei geni isolati è stata eseguita tramite RT PCR real-time. Successivamente è stata quantificata, con la tecnica del Western blot, la sintesi differenziale delle proteine dei geni sequenziati. In particolare sono andato a valutare la variazione della sintesi proteica dei seguenti geni: Statmina, Amfifisina I e Profilina 2. In base alla funzione fisiologica delle proteine sintetizzate, i cloni sono stati suddivisi in diverse categorie funzionali: metabolismo energetico mitocondriale, formazione, trasporto e rilascio delle vescicole sinaptiche, meccanismo di trasduzione dei segnali e turn-over proteico