Studio dei geni regolati dal fattore di trascrizione Xrx1: caratterizzazione ed utilizzo della proteina inducibile Xrx1-GR per la ricerca dei target diretti

Lo sviluppo dell’occhio nei Vertebrati è costituito da una serie di movimenti morfogenetici in sequenza che richiedono segnali induttivi spazialmente e temporalmente specifici a partire dallo stadio di neurula. In questa fase di sviluppo si assiste alla espansione o evaginazione bilaterale di tessuto dal cervello anteriore primitivo, che porta alla formazione delle vescicole ottiche. In Xenopus laevis, le cellule posteriori della piastra neurale iniziano a differenziarsi già al termine della gastrulazione, mentre quelle anteriori, nel territorio presuntivo della retina e del cervello anteriore, vanno incontro ad un periodo più esteso di proliferazione, differenziandosi e andando incontro così al processo di neurogenesi solo allo stadio di bottone caudale. Il gene Xrx1, appartenente alla famiglia genica degli homeobox di tipo paired, è inizialmente espresso nella piastra neurale anteriore nei territori destinati a dare origine alla retina, al diencefalo e a parte del telencefalo. Successivamente è espresso a livello della retina neurale, dell’epitelio pigmentato, del diencefalo e dell’epifisi. Esperimenti di sovraespressione ed inattivazione funzionale hanno dimostrato come questo fattore di trascrizione sia decisivo per il corretto sviluppo dell’occhio e del cervello anteriore svolgendo un ruolo essenziale nel promuovere la proliferazione e reprimere il differenziamento neuronale. Al fine di identificare i geni regolati da Xrx1 sono stati eseguiti esperimenti di microrarray che hanno permesso di confrontare il profilo di espressione di embrioni sovraesprimenti Xrx1 con quello di embrioni dove lo stesso gene era stato inattivato funzionalmente. Questa analisi ha fornito una serie di geni definiti “coerenti”, ovvero geni i cui livelli di espressione risultavano aumentati dalla sovraespressione di Xrx1 e repressi dall’inattivazione di Xrx1 o viceversa. La validazione di questi geni viene effettuata tramite esperimenti di ibridazione in situ “whole mount” su embrioni a diversi stadi di sviluppo per localizzarne l’espressione, e tramite esperimenti di Real-Time PCR per confermare e valutare, dal punto di vista strettamente quantitativo, come la loro espressione cambi, a seconda di come cambia la concentrazione interna agli embrioni di Xrx1. Il lavoro eseguito durante questo periodo di tesi ha riguardato il passaggio successivo alla validazione, ovvero l’utilizzo di un costrutto prodotto dalla fusione ‘in frame’ della regione codificante Xrx1 con quella codificante il “ligand binding” domain del recettore per glucocorticoidi (GR), allo scopo di valutare se l’interazione verificata tra Xrx1 ed i geni definiti “coerenti” sia diretta o mediata da altre proteine. Questo costrutto produce una proteina di fusione inattiva nel citosol, che sarà attivabile, e quindi trasferita nel nucleo, soltanto in presenza di un glucocorticoide sintetico, il Dexametasone (DEX). In tal caso, la proteina Xrx1-GR agirà promuovendo la trascrizione dei geni bersaglio di Xrx1. Quindi sarà possibile definire quale dei geni candidati viene controllato direttamente dalla proteina di fusione, osservando se questa sia in grado di regolarne la trascrizione anche in assenza di sintesi proteica. Inizialmente si è proceduto alla caratterizzazione di due costrutti: GR-Xrx1 (con la sequenza codificante Xrx1 posta al 3’ della sequenza codificante il GR , costrutto che ho generato durante il lavoro di tesi per la laurea triennale) e Xrx1-GR (con la sequenza codificante Xrx1 posta al 5’ della sequenza codificante il GR). In particolare, sono stati analizzati gli effetti fenotipici indotti sugli embrioni iniettati, confrontandoli con i fenotipi ottenuti sovraesprimendo il costrutto “wild type” di Xrx1 ed inoltre e’ stata valutata l’efficienza dei due costrutti, allo scopo di selezionare quello migliore per il successivo utilizzo. I risultati di questa analisi hanno portato alla scelta della proteina Xrx1-GR, poiché si è rivelata tra le due la più efficiente, in quanto ha mostrato di poter indurre un numero maggiore di fenotipi specifici a quantità inferiori di mRNA impiegate. Questa caratterizzazione si è resa necessaria perché a priori non era possibile determinare quale di queste due proteine di fusione avrebbe assunto una conformazione pienamente funzionale. Sul costrutto selezionato, è stata eseguita anche una prova molecolare tramite esperimenti di ibridazione in situ “whole mount”, per verificare se Zic2, un gene noto essere attivato da Xrx1, aumentava la sua espressione, quando nell’embrione veniva iniettato tale costrutto. Tale prova ha dato esito positivo per la proteina selezionata, Xrx1-GR, la cui attivazione ha portato ad aumento dell’espressione del gene Zic2. La fase successiva ha riguardato l’analisi dell’effetto dell’iniezione di Xrx1-GR, effettuata tramite saggi su animal caps, in cui si è verificata la presenza di alcuni dei geni coerenti tramite esperimenti di RT-PCR. Questa fase è servita a selezionare tutti quei geni che hanno subito un aumento della loro espressione genica o una attivazione in seguito all’espressione della proteina di fusione, per poi verificarne o meno l’interazione diretta con Xrx1. L’unico gene tra quelli esaminati che ha aumentato la sua espressione in seguito alla attivazione della proteina è stato Zic2. Su questo gene è stato verificato se Xrx1 agisse in modo diretto o indiretto. Tale esperimento è stato eseguito trattando animal caps provenienti da embrioni iniettati, prima con cicloesimmide, inibitore di sintesi proteica, e successivamente con il DEX, per attivare la proteina di fusione. In questo modo, è teoricamente possibile, tramite esperimenti di RT-PCR, mettere in evidenza se il gene Zic2 venga attivato direttamente da Xrx1-GR. Infatti inibendo la sintesi proteica, Xrx1-GR risulterà essere l’unica proteina in grado di funzionare e di agire come fattore di trascrizione per i suoi geni target. Al contrario, se il gene venisse attivato in presenza di DEX ma non in presenza di cicloesimmide sarà considerato target indiretto. Il risultato dell’esperimento però non ci permette di giungere a nessuna delle due conclusioni in quanto sembra che Zic2 venga attivato dall’azione della cicloesimmide, sia in presenza che in assenza della proteina attivata. Sembra però che a quantità maggiori di proteina inducibile, si assista ad un aumentata attivazione di Zic2 sia in presenza della cicloesimmide che della proteina attivata, anche se rimane una forte attivazione di Zic2 determinata dall’azione della cicloesimmide, in assenza di una attivazione della proteina Xrx1-GR