Valutazione del ruolo patogenetico di varianti missenso del gene BRCA2 mediante test di ricombinazione in lievito e analisi di inattivazione allelica in tumori umani

Il tumore alla mammella è una delle neoplasie maligne più comuni nelle donne nel mondo occidentale. Circa l’80% dei tumori alla mammella è di tipo sporadico e il rimanente 20% è rappresentato da tumori di origine ereditaria. Il 40% di questi è causato da una mutazione in uno dei due geni oncosopressori BRCA1 o BRCA2. Mentre è ovvio che una mutazione che determina una proteina tronca sia deleteria, è più difficile distinguere le mutazioni missenso dai polimorfismi neutri. Poichè il lievito S. cerevisiae si è rivelato un organismo utile per classificare UCVs (unclassified variants) di BRCA1, nel mio lavoro di tesi abbiamo effettuato esperimenti per determinare se questo organismo fosse adatto per caratterizzare UCVs di BRCA2. Si è quindi espresso BRCA2wt e le UCVs in lievito per determinare l’eventuale fenotipo; si è effettuato inoltre analisi di delezione genica (LOH) nei tumori mammari dei carriers di alcune delle nostre varianti in studio. Abbiamo utilizzato il vettore pYES-BRCA2 costruito nel nostro laboratorio, contenente il cDNA di BRCA2 sotto il controllo di un promotore inducibile da galattosio. Mediante mutagenesi sito specifica abbiamo prodotto una serie di vettori con le varianti scelte. Questi plasmidi sono stati trasformati nel ceppo diploide RS112 che consente di valutare la ricombinazione intracromosomica fra due alleli del gene HIS3, e la ricombinazione intercromosomica tra due alleli del gene ADE2 posti su cromosomi omologhi. Per verificare se il gene BRCA2 fosse trascritto abbiamo estratto l’RNA da cellule dopo induzione in galattosio e sottoposto a reazione di retrotrascrizione. Il cDNA è stato poi amplificato per PCR con tre diverse coppie di primer specifici. I risultati dimostrano che BRCA2 è trascritto ed il plasmide è a lunghezza piena. Abbiamo effettuato esperimenti per determinare se l’espressione di BRCA2wt o delle varianti influenzasse la ricombinazione. Per ottimizzare i tempi di espressione di BRCA2, abbiamo esposto le cellule a galattosio (induttore) per 4 e 24 ore. L’espressione di BRCA2wt induce ricombinazione dopo 4 e 24 ore di induzione. La variante G2748D, scelta come controllo, in quanto riportata come sicuramente patogenetica, non ha alcun effetto; dopo 4 ore di induzione si ha un incremento significativo nella ricombinazione intercromosomica nel ceppo che esprime le tre varianti M927V, S286P e R2108C. E’ quindi ipotizzabile che le varianti che hanno un comportamento paragonabile a quello del wt non siano patogenetiche. Per le varianti che si comportano in maniera diversa del wt non si può dire con certezza se siano patogenetiche o meno, infatti, questo tipo di saggio funzionale presenta numerose limitazioni e i risultati vanno visti nella globalità dei dati genetici e epidemiologici disponibili in un modello di rischio per predire la causalità delle UCVs nel cancro. Inoltre, si sono effettuati studi di delezione allelica (LOH) su tumori inclusi in paraffina dei carrier di queste varianti per convalidare l’eventuale patogenicità indicata dai risultati dei software di predizione e dei saggi funzionali in lievito; dall’analisi di questi tessuti tumorali, non è stato rilevato alcun fenomeno di LOH. Si potrebbe ipotizzare, quindi una possibile neutralità di queste varianti in studio; per le varianti M927V, S286P e R2108C la non patogenicità è rafforzata anche dai risultati del saggio funzionale in lievito. In questo lavoro, abbiamo dimostrato che BRCA2 si esprime in Saccharomyces cerevisiae; la misura dell’effetto delle varianti BRCA2 sulla ricombinazione omologa spontanea in questo organismo può quindi aiutare nel distinguere le varianti deleterie dai polimorfismi neutrali