Chemioterapia metronomica: modelli preclinici e studi clinici

Introduzione. L’angiogenesi, lo sviluppo di nuovi capillari da vasi sanguigni preesistenti è un fenomeno altamente regolato sia in condizioni fisiologiche che patologiche (es. neoplasie). Ciò che diversifica la forma patologica da quella fisiologica è il diverso equilibrio esistente tra fattori pro ed anti-angiogenici. Sia la terapia antiangiogenica classica che i nuovi schemi terapeutici denominati “chemioterapia metronomica” (che danneggiano la neovascolarizzazione tumorale usando farmaci chemioterapici convenzionali a bassa dose per lunghi periodi di tempo) offrono un nuovo e razionale tipo di trattamento dei tumori solidi e non, grazie soprattutto alla efficacia dimostrata nel controllo dello sviluppo dei foci metastatici. Inoltre, le protratte esposizioni a bassa dose di differenti agenti chemioterapici sembrano causare marcate espressioni del gene e induzioni della proteina trombospondina-1 un potente e specifico inibitore dell’angiogenesi, suggerendo un ruolo chiave di (TSP-1), come mediatore per l’attività chemioterapica metronomica. Scopi dello studio. L’obiettivo dello studio è stato quello di indagare, per la prima volta, gli effetti antiendoteliali dell’irinotecano e del suo metabolica attivo SN-38 somministrati in vivo e in vitro rispettivamente a dosi metronomiche. In particolare è stato osservato l’effetto del composto SN-38 su colture di cellule endoteliali (appartenenti sia al macro che al microcircolo); e colture cellulari di carcinoma colon rettale. È stata valutata in vivo l’inibizione della crescita tumorale, indotta con xenotrapianto di cellule umane colon rettale HT-29 effettuato nel sottocute di topi atimici (nu/nu), trattati con CPT-11 somministrato con diverse schedale. Per quanto riguarda lo studio clinico è stato dimostrato che la bassa dose metronomica di CPT-11 è clinicamente fattibile in pazienti irinotecano-resistenti, è stata descritta la farmacocinetica del CPT-11 metronomico a differenti livelli di dose e infine sono stati valutati i cambiamenti di fattori antiangiogenici (TSP-1) e proangiogenici (VEGF) e le loro rispettive relazioni con i differenti livelli di dose. Materiali e metodi. Modelli sperimentali in vitro di proliferazione cellulare bi-dimensionale sia di cellule endoteliali macro e microvascolari (HUVEC e HMVEC-d) sia di cellule tumorali (HT-29 e SW620) sono stati utilizzati per saggiare gli effetti farmacologici del metabolica attivo del CPT-11. La modulazione dell’espressione di geni per fattori pro e antiangiogenici (rispettivamente VEGF e TSP-1) è stata studiata mediante la RT-PCR e la real time-PCR. Per quanto riguarda lo studio in vivo sono stati utilizzati topi di sesso maschile nu/nu CD (25 g di peso corporeo). I topi atimici sono stati scelti per l’inoculo di cellule tumorali di colon retto perché a causa dell’assenza dell’immunità cellulo-mediata, essi rappresentano un modello sperimentale suscettibile alla crescita di cellule xenogeniche. L’impianto è consistito in 2 x 106 ± 5% di cellule tumorali di colon-retto in 0,2 ml di mezzo di coltura privo di FBS, e la sede di impianto è stata il sottocute nella regione intrascapolare. Pazienti e metodi. Lo studio clinico è stato condotto presso l’ U.O. di Oncologia Medica dell’ Az-USL 6 di Livorno diretta dal Prof. Alfredo Falcone. approvato dal comitato Etico (EudraCT 2006-001045-34) e i pazienti sono stati inseriti nello studio secondo gli appositi criteri di inclusione e esclusione. Nello studio sono stati inseriti 20 pazienti con un’età mediana di 71 anni (range 51-79) già pretrattati con più linee chemioterapiche per la malattia metastatica. Ogni settimana di trattamento sono stati eseguiti dei prelievi di sangue venoso su cui sono state condotte l’analisi farmacocinetica e l’analisi farmacodinamica. Risultati. La somministrazione metronomica di SN-38 ha inibito selettivamente la proliferazione cellulare di HMVEC-d e HUVEC. L’inibizione da parte di SN-38 è risultata essere: (HUVEC IC50 = 0,21±0,029 nM; HMVEC-d IC50 = 0,014±0,0024 nM HT-29 IC50 = 1,5±0,05 e SW620 IC50 = 0,64±0,014 nM). L’analisi Real-Time PCR dopo trattamento con SN-38 ha identificato una espressione di TSP-1 all’IC50 sperimentale di (143,4% verso 100% dei controlli per HUVEC e 249,8% verso 100% dei controlli per HMVEC-d) di (10,1% verso 100% dei controlli per SW620 e 37% verso 100% dei controlli per HT-29). L’espressione in VEGF è risultata essere di: 62,6% e 133,7% rispetto al 100% dei controlli per HUVEC e HMVEC-d rispettivamente e di 102.2% per SW620 e 75,5% per HT-29 rispetto sempre al 100% dei rispettivi controlli. Lo studio in vivo si è protratto per 63 giorni per i gruppi trattati mentre per il controllo ci siamo fermati dopo 47 giorni e il valore medio delle masse tumorali misurate nei controlli al giorno 47 è risultato essere di 3816,50 mm3. Si è dimostrato efficace il trattamento con CPT-11 (MTD) al giorno 1 seguito da CPT-11 metronomico dove la percentuale di inibizione è stata di 12,24% vs i controlli. Il trattamento con il solo CPT-11 metronomico ha dato il 24,65% di effetto vs il 100% dei controlli, mentre, il trattamento con il solo CPT-11 (MTD) una volta la settimana ha dato un effetto del 9,7% vs 100% dei controlli. Alla fine dell’esperimento in vivo gli animali sono stati sacrificati il tumore espiantato e utilizzato per l’indagine immunoistochimica; abbiamo osservato come il trattamento metronomico con CPT-11 abbia determinato un riduzione della densità dei vasi del microcircolo senza peraltro modificare l’ espressione del VEGF delle cellule tumorali. Per la prima volta viene suggerito come anche per il CPT-11 l’attività antiangiogenetica possa essere sostenuta da un mediatore endogeno come la TSP-1. Per quanto riguarda invece lo studio clinico abbiamo osservato come il trattamento è stato ben tollerato dai pazienti, infatti non sono state osservate tossicità superiori al grado 1° secondo la scala NCI. Alla prima rivalutazione, eseguita dopo 8 settimane, è stata osservata invece una stabilità di malattia in quattro pazienti (20%) di cui 2 hanno proseguito il trattamento infusionale per una mediana di 10 settimane (range 8-12 per un totale di 16-20 settimane) mentre 1 paziente ha interrotto il trattamento per scarsa compliance; la stabilità di malattia ha avuto una durata mediana di 3,9 mesi (range 3-5). In sedici pazienti (80%) è stata invece evidenziata una progressione strumentale e/o clinica di malattia. Dopo un follow-up mediano di 20 mesi, la median progression-free survival (PFS) è stata di 2,07 mesi (95% CI: 1,99-2,14) e la median overall survival (OS) è stata di 8,4 mesi (95% CI: 5,1-11,7). L’analisi farmacocinetica del CPT-11 e dei suoi metaboliti è risultata fattibile dimostrando che il CPT-11 è dosabile per tutti e tre i livelli di dose. Nella valutazione dei parametri farmacodinamici abbiamo osservato alle basse dosi un simultaneo aumento nei livelli di TSP-1 e una diminuzione nella concentrazione di VEGF, suggerendo uno spostamento verso una attività antiangiogenica. Un aumento marcato si ha anche nell’espressione di TSP-1, mentre alla dose più alta dopo un aumento iniziale la secrezione di TSP-1 ritorna ai livelli basali. Per quanto riguarda il VEGF i livelli di espressione restano molto simili ai livelli basali per tutte le tre dosi. Conclusioni. I marcati effetti anti-endoteliali della somministrazione metronomica dell’SN-38 sono strettamente selettivi, sebbene vi siano cambiamenti simili nell’espressione genica di TSP-1 e VEGF nelle cellule tumorali ed endoteliali. Questi risultati confermano il ruolo chiave di TSP-1 nell’attività antiproliferativa selettiva sulle cellule endoteliali. Nello sudio in vivo condotto con CPT-11 la comparsa di una massa tumorale visibile e misurabile nei topi atimici è stata osservata dopo circa 4-7 giorni dall’inoculo delle cellule tumorali umane. I risultati sono stati soddisfacenti per lo studio condotto con CPT-11. Questi dati suggeriscono la possibilità di poter effettuare in vitro trattamenti di combinazione simultanea o consecutiva con farmaci antiangiogenici ad esempio ZD6474 o altri chemioterapici a bassa dose come oxaliplatino. L’Irinotecano metronomico è risultato inoltre clinicamente fattibile, non tossico e quindi un promettente trattamento in quei pazienti con cancro colon-rettale metastatico irinotecano resistenti. Le basse concentrazioni del metabolita attivo SN-38 sono distinguibili nel plasma e i livelli plasmatici di TSP-1, l’espressione genica di TSP-1 sono aumentati dopo infusione metronomica di CPT-11 alle basse dosi, suggerendo un possibile ruolo di questo inibitore endogeno dell’angiogenesi. In futuro possono essere esplorati altri trattamenti clinici come la somministrazione di rubitecan, una camptotecina orale, o studi di combinazione con farmaci chemioterapici già approvati per il cancro colo-rettale come la capecitabina