Purificazione e caratterizzazione enzimatica dell'anaphase promoting complex, un regolatore essenziale del ciclo cellulare

L’ubiquitinazione è uno dei meccanismi regolatori fondamentali del ciclo cellulare. La progressione del ciclo cellulare è infatti finemente regolata dalla degradazione controllata, nel tempo e nello spazio, di specifiche proteine che, modificate covalentemente da catene di ubiquitina, diventano target di degradazione per il proteasoma. L’ubiquitinazione è pertanto un processo controllato ed avviene grazie a complessi proteici multienzimatici con specificità diversa per vari targets. Il sistema di ubiquitinazione è composto almeno da tre enzimi chiave - E1, E2, E3 - che sono richiesti per l’iniziale attivazione e coniugazione dell’ubiquitina (E1 – ubiquitin activating enzyme – ed E2 – ubiquitin conjugating enzyme - , rispettivamente) e per il suo legame covalente alla proteina target (E3 – ubiquitin ligase). Durante lo svolgimento della tesi di laurea, ho focalizzato la mia attenzione verso una E3 ubiquitin ligase, l’anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C), coinvolta nella degradazione di proteine regolatorie del processo mitotico. L’APC/C è un complesso enzimatico di 1.5-MDa composto da almeno 12 subunità che lavora in concerto con specifci E1 ed E2 e che necessita di un coattivatore (Cdc20 o Cdh1) per il riconoscimento e il binding di specifici substrati. Obiettivo del lavoro di tesi è la comprensione della regolazione di questo enzima attraverso la ricostituzione in vitro della attività ubiquitinante APC/C mediata. A tale scopo, avvalendomi di tecniche di biologia molecolare e biochimica, ho prodotto e purificato diversi componenti necessari per la corretta attività enzimatica; tra questi l’E2 – ubiquitin conjugating enzyme - UbcH10 e il substrato dell’APC/C Cyclin B1. Ho inoltre purificato l’APC/C tramite immunoprecipitazione da cellule HeLa. Al fine di garantire la più alta specificità possibile nel segnale derivante dal saggio in vitro, il substrato Cyclin B1 è stato preventivamente iodinato (125I) per permetterne la detezione attraverso autoradiografia. Il saggio che ho messo a punto con queste componenti purificate è assai efficace, in quanto permette una completa ubiquitinazione del substrato in vitro in circa 30 minuti di reazione. Il saggio serve adesso come base per caratterizzare le proprietà enzimatiche dell’APC/C. In particolare, gli studi si concentrano sulla dipendenza della attività dell’APC/C da1) presenza del coattivatore (Cdc20 o Cdh1); 2) stato di modificazione (fosforilazione in particolare); e 3) presenza di binding partners, in particolare i regolatori negativi del checkpoint mitotico (spindle assembly checkpoint). Inoltre, durante questi mesi, ho seguito la produzione di anticorpi (mono e policlonali) contro una subunità dell’enzima, Apc7, avendone preventivamente espresso e purificato un frammento, al fine di poterli utilizzare per l’immunoprecipitazione del complesso ed eventualmente per la sua localizzazione mediante tecniche di immunofluorescenza