Effetti del PACAP-38 in forme di plasticità sinaptica nella sanguisuga Hirudo medicinalis

PACAP-38 è un peptide di 38 amminoacidi la cui sequenza è ben conservata in molte specie animali. Agisce da neuromodulatore e da neurotrasmettitore nel sistema nervoso centrale e periferico (Arimura, 1998; Vaudry et al., 2000) ed inoltre è presente in diversi tessuti periferici. Ciò suggerisce un suo ruolo regolatorio in molte funzioni fisiologiche. Alcuni studi hanno evidenziato un suo ruolo nel migliorare l’apprendimento e la memoria sia nei Vertebrati che negli Invertebrati (Arimura, 1992; Masuo et al., 1993). Ad esempio, nei ratti è stato dimostrato che PACAP-38, a bassi dosaggi, migliora significativamente l’acquisizione del paradigma di passive avoidance response (Sacchetti et al., 2001). A livello dell’ippocampo, struttura coinvolta nei fenomeni di apprendimento e memoria, è stato evidenziato un aumento dei fEPSPs nella regione CA1 durante la trasmissione sinaptica basale (Roberto e Brunelli, 2000; Roberto et al., 2001). In alcuni Invertebrati la mancanza di un peptide omologo al PACAP dei Mammiferi, determina deficit nell’apprendimento (Kandel and Abel, 1995). In Drosophila, per esempio, i mutanti per il gene che codifica per il neuropeptide PACAP-simile amnesiac (Feany and Quinn, 1995), hanno disturbi nel consolidamento mnemonico (Davis, 1996). Allo scopo di indagare i meccanismi d’azione di PACAP-38 sono stati analizzati gli effetti del neuropeptide nell’induzione al nuoto nella sanguisuga H. medicinalis, dove è possibile correlare cambiamenti del comportamento con modificazioni dell’attività cellulare e dei circuiti neurali. L’analisi è stata condotta sia a livello comportamentale sia a livello cellulare. In animali aventi il ganglio cefalico disconnesso dal primo segmentale sono stati indotti cicli di nuoto applicando sulla cute in posizione caudale lievi stimoli elettrici (stimolo test) costituiti da treni della durata di 1,6 s di impulsi quadri (5 ms, 8,3 Hz). Mediante un opportuno software collegato ad un dispositivo on/off è stato misurato l’intervallo di tempo che intercorre tra l’applicazione dello stimolo test e l'inizio del nuoto (latenza), prima e dopo iniezione di una soluzione contenente PACAP-38 a varie concentrazioni(0,01 nM - 1 nM). La valutazione delle variazioni di latenza indotte dall’iniezione di PACAP-38 ha dimostrato che alla concentrazione di 0,1 nM il neuropeptide produce effetto sensitizzante. Lo stimolo test da noi utilizzato nel paradigma dell’induzione al nuoto attiva selettivamente le cellule sensoriali T. la riduzione della latenza riscontrata in seguito all’applicazione di PACAP-38 indica una maggiore responsività dell’animale allo stimolo test, suggerendo che PACAP-38 possa modificare le caratteristiche elettrofisiologiche esibite dai neuroni T. Sono state quindi condotte registrazioni intracellulari da neuroni T appartenenti a gangli segmentali estratti da animali naive, e perfusi per 5 minuti con PACAP-38 5•10-3 nM. Sono stati valutati i seguenti parametri elettrofisiologici: voltaggio a riposo (Vm), resistenza di ingresso (Rm) misurata su impulsi iperpolarizzanti di 200 msec, 0,5 nA e ampiezza dell’iperpolarizzazione postuma (AHP). Quest’ultima caratterizza il “firing” dei neuroni T ed è responsabile di variazioni dell’efficacia sinaptica (Scuri et al., 2002; Scuri et al., 2007). I nostri dati hanno evidenziato che PACAP-38 determina una riduzione significativa dell'ampiezza della AHP che si osserva a 20' di lavaggio senza indurre cambiamenti di Vm e Rm. L’AHP, nei neuroni T, è determinata principalmente da un incremento dell’attività della pompa Na+ /K+-ATPasi e solo parzialmente dall’attivazione di una conduttanza K+/Ca2+-dipendente apamina-sensibile. In presenza dell’inibitore apamina 1 nM PACAP-38 5•10-3 nM si è dimostrato in grado di ridurre l’ampiezza dell’AHP, indicando che l’azione del neuropeptide coinvolge una modulazione della pompa Na+ /K+-ATPasi. Il fatto che gli effetti di PACAP-38 si manifestano dopo 20 minuti dall’applicazione suggerisce che il neuropeptide attivi una cascata di trasduzione del segnale intracellulare. Allo scopo di comprendere i meccanismi intracellulari attivati da PACAP-38, sono stati condotti esperimenti per valutare la via dei secondi messaggeri attivata dal neuropeptide: l’utilizzo di LY 83583 0,1 microM, un bloccante delle guanilato ciclasi, ha dimostrato che non è coinvolta la via del guanosin monofosfato ciclico; mentre esperimenti in cui è stato utilizzato il bloccante dell’adenilato ciclasi MDL12330A 1 microM hanno messo in evidenza un probabile coinvolgimento della via dell’cAMP. Dai nostri risultati emerge che PACAP-38 attraverso la via del cAMP modifica l’integrazione sensoriale operata dai neuroni T producendo un effetto sensitizzante in risposta alle lievi stimolazioni tattili che inducono il nuoto nella sanguisuga