Ruolo dell'omeogene Otx1 nell'osteogenesi murina

L’osteogenesi è un processo complesso e finemente regolato che porta alla formazione dell’osso attraverso una sequenza di eventi che ha inizio con il commitment di progenitori indifferenziati. Questi differenziano in pre-osteoblasti e poi in osteoblasti maturi i quali hanno la funzione di sintetizzare la matrice ossea e provvedere alla mineralizzazione della stessa. Inclusi nella matrice mineralizzata si ritrovano gli osteociti, l’ultimo step del processo differenziativo degli osteoblasti. Negli ultimi anni sono stati fatti significativi progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari che controllano la differenziazione osteogenica, tuttavia molti aspetti della regolazione di tale processo sono ancora da chiarire. Quel che è noto con certezza è che gli osteoblasti derivano da una popolazione di cellule staminali presenti nel midollo osseo: le cellule staminali mesenchimali (MSCs). Si tratta di cellule clonogeniche pluripotenti in grado di differenziare in cellule di diversi tessuti di origine mesodermica, quali osso, cartilagine, muscolo e grasso. Data la loro multipotenzialità e l’estesa capacità di autorinnovamento, le MSCs sono una notevole promessa nella terapia genica e cellulare per la cura di numerose patologie umane. Molti studi sostengono l’ipotesi che cellule staminali e precursori di diversi tessuti siano regolati da meccanismi molecolari comuni. In tale ottica nel laboratorio in cui ho svolto il mio lavoro di tesi si sta verificando l’ipotesi che l’omeogene Otx1, codificante un fattore trascrizionale essenziale nello sviluppo embrionale, contribuisca al controllo di cellule staminali mesenchimali, in particolare durante l’osteogenesi. Questo gene, appartiene alla sottofamiglia degli omeogeni Otx, omologhi nei Vertebrati del gene Orthodenticle di Drosophila, e svolge una funzione essenziale nella morfogenesi del cervello e nella formazione degli organi di senso. Inoltre durante la vita adulta è coinvolto anche nella produzione delle cellule del sangue, contribuendo alla regolazione di cellule staminali e precursori ematopoietici. Diverse sono le ragioni che motivano questo studio: • Ci sono evidenze che suggeriscono che cellule ematopoietiche e osteoblasti possano derivare da un precursore comune; • Insieme alle cellule endoteliali le MSCs e gli osteoblasti maturi costituiscono il microambiente necessario al mantenimento della staminalità delle HSCs (nicchia); • I meccanismi molecolari che regolano le MSCs sono ancora poco conosciuti; • Le MSCs rappresentano un buon sistema per avvalorare l’ipotesi che i geni Otx controllino proprietà comuni a diversi tipi di cellule staminali. Scopo della mia tesi è stato quello di valutare l’espressione del gene Otx1 in relazione a quella di alcuni noti marcatori osteogenici e di alcune famiglie di geni regolatori coinvolti nello sviluppo scheletrico embrionale. Questa indagine è stata condotta sia in cellule indifferenziate sia a tempi diversi durante il differenziamento osteogenico, utilizzando due modelli sperimentali: 1) una linea cellulare murina, MC3T3-E1, ottenuta dalle ossa del cranio di embrione di topo, che non è trasformata e riproduce fedelmente le fasi di differenziazione da pre-osteoblasto ad osteoblasto maturo; 2) colture primarie di MSCs murine prelevate dal midollo osseo ed espanse e differenziate in vitro. Ho analizzato l’espressione del gene Otx1 e degli altri geni presi in considerazione tramite PCR quantitativa (Real Time qPCR) e verificato lo stadio differenziativo delle cellule esaminate attraverso una colorazione istochimica che mette in evidenza la formazione di matrice di fosfati di calcio tipica degli osteoblasti maturi. I risultati ottenuti hanno mostrato che Otx1 e altri regolatori dello sviluppo sono espressi in MSCs indifferenziate e la loro attività trascrizionale è modulata durante il differenziamento osteogenico. Queste osservazioni suggeriscono che Otx1 sia coinvolto nel processo osteogenico e al fine di comprenderne meglio la funzione sono in corso studi su cellule mesenchimali di mutanti knock-out in cui il gene è stato inattivato