Studio degli effetti del cAMP intracellulare sui canali cationici meccanosensibili dei neuroni di Hirudo medicinalis.

I canali cationici meccanosensibili (SACC per stretch-activated cationic channels) hanno, in generale, un ruolo nella regolazione della motilità cellulare ed, in particolare, essi modulano la dinamica dei coni di crescita neuronali. Questi canali hanno selettività cationica con alta conduttanza per il Ca2+, inoltre essi possono co-attivare i canali voltaggio-sensibili del calcio attraverso la depolarizzazione della membrana. Pertanto, la loro attivazione deve essere potentemente regolata, per evitare la citotossicità dovuta ad un possibile accumulo di calcio intracellulare. I due principali meccanismi di meccanoprotezione (ridotta meccanosuscettibilità) sono la ripiegatura della membrana plasmatica ed una opportuna disposizione di elementi citoscheletrici in grado di assorbire parte dell’energia associata alle sollecitazioni meccaniche. Precedenti ricerche in patch-clamp hanno mostrato che i neuroni centrali di Hirudo medicinalis esprimono SACC, la cui attività è modulata da fattori diversi, quali il pHi , la [Ca2+]i, il potenziale di membrana e la [cAMP]i. Lo scopo di questa tesi è stato studiare l’effetto di aumenti della [cAMP]i, potente inibitore dei SACC, sulle elevazioni della [Ca2+]i indotte da stimoli ipotonici. Gli esperimenti sono stati eseguiti su singoli neuroni dei gangli segmentali di Hirudo medicinalis, caricati con Fura 2 per la misura raziometrica della [Ca2+]i. Le cellule sono state osservate con un obiettivo a immersione in acqua CF Fluor 40X, attorno al quale era realizzato un sistema di micro-superfusione. Il preparato veniva eccitato in rapida successione a 340 e 380 nm, mentre le relative immagini fluorescenti a 510 nm venivano acquisite. Il rapporto tra le immagini ottenute alle due lunghezze d’onda di eccitazione, corrette per il background, fornivano una misura del livello di calcio libero intracellulare. Dopo una misura della concentrazione basale di calcio, si procedeva alla stimolazione con soluzione ipotonica. Questo trattamento induceva un aumento di volume cellulare ed il conseguente aumento della [Ca2+]i. Nel corso della fase di salita del segnale del calcio, veniva aggiunta forscolina 10 microM alla soluzione ipotonica, con l’intento di attivare le adenilato-ciclasi endogene. Come atteso, l’applicazione di forscolina in assenza di inibitori delle fosfodiesterasi, ha determinato in 14 su 17 cellule studiate una transitoria riduzione o un’inversione della fase ascendente dell’influsso di calcio, in accordo con un ruolo inibitorio del cAMP sui SACC. Tuttavia, l’aumento di cAMP determinava un flesso nel grafico della variazione del volume cellulare, precedente o al più contemporaneo alla variazione del calcio. Questo dato suggerisce che elementi citoscheletrici piuttosto che direttamente i SACC siano i target del cAMP. In una seconda serie di esperimenti singoli neuroni sono stati trattati con forscolina, in assenza di stimolazione ipotonica. Sono state documentate caratteristiche variazioni di volume, che confermano una suscettibilità del citoscheletro di questi neuroni alla [cAMP]i. La sperimentazione è stata quindi orientata verso l’uso di una metodologia più accurata della video-microscopia, per misurare i movimenti della membrana indotti dal cAMP. Mediante microscopia a scansione di conduttanza ionica (SICM), sono stati registrati i movimenti della membrana di singoli neuroni, indotti dalla applicazione di forscolina. Immagini in 3 D e con risoluzione sub-micrometrica hanno rivelato una transitoria fase di contrazione seguita da un lento e prolungato rilasciamento. Questi risultati rendono improbabile l’ipotesi di una modulazione diretta del cAMP sul canale e più probabile una sua azione indiretta, mediata da elementi citoscheletrici. Pertanto, la futura sperimentazione tenderà a identificare i target citoscheletrici coinvolti