STUDIO DEL DIFFERENZIAMENTO DELLE CELLULE M-07e, COME MODELLO IN VITRO DI PATOLOGIE MIELOPROLIFERATIVE

Introduzione: La megacariocitopoiesi è un complesso processo biologico, regolato da varie citochine come la trombopoietina (TPO) e il fattore di crescita per i macrofagi ed i granulociti (GM-CSF). Esso comprende una serie di eventi cellulari che iniziati con la cellula staminale pluripotente portano alla biogenesi delle piastrine da parte dei megacariociti maturi. La proliferazione anormale dei megacariociti, conseguente ad una disfunzione di questo processo, è spesso associata a malattie mieloproliferative e rappresenta la caratteristica principale della trombocitemia essenziale (TE) e della mielofibrosi idiopatica (MFI). Scopo dello studio: Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare sulla linea cellulare megacarioblastica M-07e, considerata un buon modello in vitro di TE e di MFI: 1. il possibile effetto proliferativo e/o differenziativo di OGP(10-14) (estremità carbossi-terminale del peptide di crescita osteogenico), e di PP2 (inibitore delle Src-chinasi); 2. il meccanismo di trasduzione del segnale coinvolto in questi processi. Metodi: La proliferazione delle M-07e dipendenti da TPO (M-07e/TPO) o da GM-CSF (M-07e/GM-CSF) è stata valutata tramite il test colorimetrico MTT. Il differenziamento delle M-07e/TPO è stato valutato attraverso l’osservazione al microscopio ottico della loro morfologia cellulare e tramite la ricerca immunoistochimica del fattore di von Willebrand (vWF). Nello studio del meccanismo di trasduzione del segnale indotto da OGP(10-14) e da PP2 è stato indagato il coinvolgimento di RhoA (una “small” proteina GTPasica ), Fyn (un membro della famiglia delle Src-chinasi), TGF?1(il fattore di crescita trasformante ?1) ed Mpl (recettore della TPO) tramite tecniche d’immunocitochimica, analisi d’immagine e l’utilizzo di inibitori specifici. La valutazione dell’effetto di PP2 su campioni clinici è stata eseguita con il test CFU-Mk su un aspirato midollare di paziente affetto da TE. Risultati: Sia OGP(10-14) che PP2 inibiscono la proliferazione delle M-07e/TPO ma non delle M-07e/GM-CSF inducendo solo le prime al differenziamento. Questo processo è evidente dal cambiamento morfologico delle cellule e dalla comparsa in queste dell’espressione del vWF. OGP(10-14) e PP2 attivano RhoA, determinano un aumento intracellulare del TGF?1 e inducono una down regolazione di Fyn. Inoltre OGP(10-14)/PP2 sembra indurre una down modulazione di Mpl. Dai dati preliminari ottenuti, l’inibitore delle Src sembra essere efficace nella inibizione della formazione di colonie megacariocitarie su un campione midollare di paziente affetto da TE. Conclusioni: Questi risultati dimostrano che OGP(10-14) e PP2 hanno effetti simili e complementari sulla linea M-07e/TPO, inducendone il differenziamento. Lo studio delle possibili molecole coinvolte nel meccanismo di trasduzione del segnale ha evidenziato che l’aumento dell’espressione di TGF?1 e la probabile down modulazione di Mpl sono dovute alla regolazione reciproca di RhoA e delle proteine Src. I risultati ottenuti con PP2 sul campione di paziente suggeriscono il possibile utilizzo di farmaci inibitori delle proteine Src nelle patologie mieloproliferative come la TE