Regioni instabili nel cancro: un approccio epigenetico e uno molecolare

L’instabilità genomica è un fenomeno molto complesso che caratterizza le cellule tumorali, può essere osservata come eterogeneità del cariotipo nell’ambito di ciascun tipo di tumore e in differenti parti dello stesso tumore. L’instabilità genetica è stata dimostrata essere un fattore deteminante nello sviluppo tumorale. In questa tesi sono stati utilizzati due approcci differenti per caratterizzare questo fenomeno. Un primo approccio di tipo epigenetico è volto a caratterizzare alterazioni del tempo di replicazione in loci instabili della regione cromosomica 13q soggetti a delezioni e a perdita di eterozigosi. Un secondo approccio di tipo molecolare è stato usato per caratterizzare il gene CDK4 frequentemente coinvolto in processi di amplificazione. Nella prima parte della tesi lo stato replicativo della regione cromosomica 13q è stato analizzato in campioni di Adenoma e Carcinoma Papillare della Tiroide e di Mieloma Multiplo. A tal scopo è stato utilizzato il metodo d’ibridazione in situ fluorescente (FISH) sia in mono che in dual color. In preparati di tessuto tiroideo ottenuti per strisciamento od apposizione è stato analizzato il locus RB1, mentre in cellule interfasiche da colture di midollo osseo sono state analizzate le tre regioni cromosomiche RB1, D13S319 e 13q34. I risultati ottenuti hanno evidenziato alterazioni dello stato replicativo in entrambi i tipi di tumore. In particolare i tessuti tiroidei mostrano un aumento di asincronosmo replicativo nel tessuto tumorale rispetto al tessuto normale e nei carcinomi rispetto agli adenomi. Nel mieloma multiplo l’analisi di loci con tempo di replicazione molto diverso (13q34 molto precoce ed RB1 tardivo) ha permesso di stabilire un ordine temporale di replicazione dei due loci e di evidenziare la presenza di cellule che presentano un alterazione di questo ordine temporale. Lo scopo della seconda parte di questo lavoro di tesi è stato quello di caratterizzare nel Neuroblastoma il ruolo dei geni controllati dal fattore di trascrizione MYCN (come il gene CDK4), che, essendo coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare, sono responsabili della fedeltà mitotica. La regolazione dell’espressione di CDK4 è stata analizzata in linee cellulari di Neuroblastoma utilizzando il saggio della doppia luciferasi. E’ stato poi mostrato che la regolazione da parte di Mycn è svolta attraverso il legame con le E-box poichè la mutazione contemporanea delle 4 Ebox abolisce l’attività del promotore. E’ stato infine analizzato l´effetto dell’inibizione di CDK4 sulla vitalità in linee cellulari di neuroblastoma per verificare se bloccando l’attività di uno dei geni chiave per la regolazione del ciclo cellulare fosse possibile rallentare o fermare la crescita tumorale. A tal fine è stata indotta l’ inibizione dell’attività chinasica della proteina attraverso una molecola altamente specifica ed è stata indotta inibizione dell’espressione del gene per RNA interference. I risultati ottenuti hanno mostrato una diminuzione della vitalità cellulare con entrambi gli approcci. Essi consentono di considerare l’ inibizione di CDK4 come possibile meccanismo terapeutico in casi di Neuroblastoma