Alterazione dello stato replicativo in loci del cromosoma 13q frequentemente deleti nel Mieloma Multliplo

Candidato: Solange Sorçaburu Cigliero Via N. Paganini 24, Colignola, Pisa tel: 347-8410268 Tesi sperimentale presso il Dipartimento di Biologia, sezione Genetica. Relatore: Prof.ssa Sbrana tel: 050-2211507 Alterazione dello stato replicativo in loci del cromosoma 13q frequentemente deleti nel Mieloma Multliplo Il Mieloma Multliplo (MM) deriva dalla trasformazione neoplastica delle plasma cellule del midollo osseo. Nel MM si verificano molto frequentemente anomalie cariotipiche; le più ricorrenti sono le traslocazioni che coinvolgono il cromosoma 14 nel locus delle immunoglobuline (14q32) e le aneuploidie del cromosoma 13 (monosomia del 13 e delezione della banda 13q14). Queste ultime sono presenti nel 40-50% dei campioni e sono associate ad una minore ad una minore risposta al trattamento chemioterapico e quindi ad una prognosi peggiore. E' stato quindi ipotizzato che i geni presenti in questa regione possano avere la funzione di geni soppressori di tumore. Dal momento che la ricerca di mutazioni in questi geni associabili ad un fenotipo tumorali ha dato esiti negativi, è stato proposto il coinvolgimento di fenomeni epigenetici in grado di modificare l'espressione genica senza alterazioni della sequenza. Scopo della tesi è consistito nel caratterizzare lo stato replicativo di questa regione in campioni di midollo osseo di soggetti affetti da MM. In particolare abbiamo cercato di rilevare l'eventuale presenza di fenomeni di replicazione asincrona o di altre alterazioni del tempo di replicazione, anomalie potenzialmente rappresentative dell'esistenza di alterazioni epigenetiche. Il tempo di replicazione durante la fase S può essere un marker del silenziamento genico, perchè la frazione della fase S in cui i loci si replicano è correlata al loro stato trascrizionale; infatti i geni attivamente espressi si replicano precocemente mentre i geni non espressi hanno replicazione tardiva. Conseguentemente la replicazione dei due alleli di geni ad aspressione biallelica è generalmente sincrona mentre i geni ad espressione monoallelica ( es. geni soggetti ad imprinting) si replicano in maniera asincrona; anche in questo caso l'allele trascrizionalmente attivo si replica precocemente rispetto a quello non espresso. In letteratura sono riportati casi in cui geni ad espressione biallelica mostrano asincronismo replicativo in cellule di soggetti con malattie tumorali (soprattutto tumori ematologici ma anche per il cancro alla cervice uterina). L'attività di ricerca ha riguardato lo studio del tempo di replicazione di 3 regioni cromosomiche in 13q (RB1, D13S319 e 13q34) in campioni di midollo osseo di soggetti con mieloma multiplo che non mostravano delezioni in 13q e di soggetti sani. Lo stato replicativo è stato valutato usando la FISH (ibridazione in situ fluorescente), una tecnica citogenetica, che permette di distinguere in nuclei interfasici tra sequenze di DNA replicate e non replicate. Ciascuna sequenza di DNA mostra un segnale singolo se non è stata replicata, e un segnale doppio dopo la replicazione. Le cellule in cui entrambi gli alleli non sono stati replicati, mostrano due segnali singoli (cellule SS), quelle in cui entrambi sono stati replicati mostrano due segnali doppi (cellule DD). Nel caso di asincronismo replicativo, le cellule mostrano un segnale singolo e uno doppio, il primo relativo alla sequenza non replicata e il secondo alla sequenza già replicata (cellule DS). Gli esperimenti di FISH sono stati eseguiti con 3 sonde commerciali di due diversi colori; le sonde per RB1 (LSI RB1, Vysis) e per il locus D13S319 (LSI D13S319, Vysis) sono marcate con il fluorocromo orange, mentre la sonda per locus 13q34 (LSI 13q34, Vysis) è marcata con il fluorocromo verde. I risultati hanno permesso di stabilire che per tutti e tre i loci la percentuale di nuclei asincroni (DS) è maggiore nei casi rispetto al controllo e raggiunge valori paragonabili a loci soggetti ad imprinting. Sulla base della proporzione delle cellule DS e DD è stato inoltre stimato il tempo di replicazione dei singoli loci (DS+DD%): il locus 13q34 risulta essere un locus a replicazione precoce (la media di DS+DD% è 76,59 in campioni MM), mentre i loci RB1 e D13S319 hanno un tempo di replicazione più tardivo e molto simile tra loro. In base ai risultati ottenuti abbiamo ipotizzato che l’alterazione dello stato replicativo possa essere dovuta ad una variazione dell’organizzazione della cromatina, possibilmente associata a metilazione del DNA o ad acetilazione degli istoni. Abbiamo pertanto iniziato uno studio esplorativo volto a verificare i meccanismi coinvolti analizzando i possibili effetti sul livello di asincronismo di un agente demetilante (azacitidina) e di un agente deacetilante gli istoni (tricostatina A). I risultati preliminari ottenuti dalle cellule di midollo di soggetti con MM non indicano modificazioni significative. Nel complesso i risultati dimostrano che la fedeltà nella replicazione del DNA è parzialmente alterata nei campioni di MM e la perdita di sincronia nella replicazione degli alleli interessa tutti e tre i loci analizzati. Questi cambiamenti possono riflettere l’instabilità genomica acquisita dalle cellule tumorali. Data la relazione tra tempo di replicazione e attività trascrizionale, è possibile che derivino da cambiamenti epigenetici richiesti per stabilizzare il fenotipo tumorale. Per cui questi cambiamenti epigenetici potrebbero rivelarsi degli utili marcatori per caratterizzare l’eterogeneità genetica del MM.