Realizzazione di costrutti genici per lo studio dell'effetto di geni alterati da inserzioni di T-DNA in Arabidopsis thaliana

In biologia vegetale, la mutagenesi inserzionale è uno strumento molto utilizzato per la genomica funzionale. Nello studio e nella caratterizzazione dei mutanti inserzionali emergono, tuttavia, una serie di problematiche, legate alla natura delle inserzioni dei frammenti di T-DNA, che ostacolano l’individuazione univoca dei geni responsabili della mutazione d’interesse e del relativo fenotipo. A questo proposito, nella presente tesi vengono descritti due casi di studio come esempio delle strategie sperimentali che devono essere messe in atto in Arabidopsis thaliana per sviluppare un efficace metodo di studio dei geni responsabili dei fenotipi mutati. Due mutanti inserzionali isolati per le loro caratteristiche fenotipiche, il mutante tin e il mutante now, sono stati analizzati andando prima ad individuare i putativi geni correlabili alle due mutazioni e quindi si è sviluppato un progetto di caratterizzazione genotipica che consentisse, sfruttando le tecniche di trasformazione genetica, di complementare la mutazione e di determinare quale fosse la porzione genica responsabile del fenotipo mutato. Nel caso del mutante tin (“turanose insensitive”), mostrante capacità di tolleranza al disaccaride turanosio, i geni responsabili dell’alterazione osservata (At3g11260 e At1g48610), sono fusi a causa di una traslocazione cromosomica, ed il gene At3g11260 risulta troncato all’altezza dell’ inserzione di T-DNA. Per questo motivo, si è prima ipotizzato che la mutazione potesse essere legata alla formazione del gene chimerico, ed è quindi stato realizzato un costrutto specifico per la sua sovraespressione. Nell’ipotesi, invece, che solo una delle due porzioni geniche fosse effettivamente responsabile dell’alterazione fenotipica, sono stati realizzati altri costrutti genici, recanti, rispettivamente, il gene At3g11260 troncato, At3g11260 fuso con il gene per la “green fluorescent protein” (tale strategia è stata intrapresa per verificare se At3g11260 troncato fosse responsabile unico della mutazione o se fosse necessaria una fusione con un qualsiasi altro gene per provocarne l’alterazione), e, nell’eventualità che il responsabile della mutazione fosse At1g48610, è stato realizzato anche un costrutto recante il gene da solo o fuso con un altro. In tutti i casi i costrutti sono stati realizzati con metodo tradizionale. Per quanto riguarda il mutante now (“no-waving”), scelto perché mostrante un fenotipo fortemente dissimile dalla pianta wild type sia in aria che in anossia, il gene mutato a causa di un’inserzione di T-DNA è At3g03270, il cui trascritto, a seguito della mutazione, risulta parzialmente fuso con una sequenza del T-DNA stesso. La strategia di caratterizzazione adottata in questo caso è stata quella di complementare la mutazione realizzando differenti costrutti genici recanti il cDNA del gene mutato, rispettivamente, intero, troncato o fuso con il T-DNA o con un gene reporter. Per verificare anche dove fosse localizzata l’espressione del gene mutato, si è prodotto anche un costrutto recante un gene reporter sotto il controllo del suo promotore.I tentativi di complementazione sono stati effettuati, oltre che in piante wild-type, anche in piante knockout per il gene d’interesse al fine di verificare se la trasformazione potesse ristabilire il fenotipo alterato. In questo secondo caso di studio la realizzazione dei costrutti ha visto l’utilizzo della tecnica Gateway®