Analisi bidimensionale di proteine indotte e represse da shock termico in Medicago sativa

La risposta delle piante a stress abiotici riveste notevole importanza per le implicazioni che può avere sulla produttività delle piante. Dai dati riportati finora in letteratura è possibile affermare che la risposta allo stress è essenzialmente universale e, quindi, fondamentale per la sopravvivenza degli organismi viventi perché parte integrante dei processi di adattamento delle popolazioni agli ambienti naturali in cui esse vivono. Presso i laboratori del centro di ricerca, Metapontum Agrobios, dove è stata svolta l’attività sperimentale inerente il lavoro di questa tesi, è in atto un progetto di ricerca “PROGETTO HSP MEDICA”. L’obiettivo del progetto è quello di sviluppare una tecnologia per l’isolamento e lo studio di proteine HSP indotte da shock termico su piante di erba medica (Medicago sativa). L’interesse societario è dettato dalla potenzialità che queste molecole potrebbero avere nella produzione farmaceutica di vaccini o nelle terapie basate sulla risposta immunitaria come, ad esempio, quelle relative a malattie tumorali. Il lavoro di questa tesi si inserisce in questo progetto con l’obiettivo di studiare a livello proteomico, tramite analisi bidimensionali, le differenze tra piante di erba medica controllo e piante sottoposte a stress termico. Le piantine sono state sottoposte a shock termico in una stufa da laboratorio, ad una temperatura di 50°C per 1 ora e dopo 1 ora dal trattamento sono state tagliate (fusto e foglie) e conservate a -40°C. Il materiale vegetale è stato utilizzato, per la messa a punto di un protocollo di estrazione di proteine più adatto a Medicago sativa. Per la separazione in prima dimensione (isoelettrofocalizzazione), in un primo momento, sono stati utilizzati gel strip da 7 cm al fine di poter verificare la qualità e la quantità dell’estratto proteico ottenuto per ogni campione, confrontare i valori di concentrazione e definire il range di pH più adatto da utilizzare. Per questo scopo, sono stati provati gel strip a diverso range di pH: 3-6, 4.7-5.9, 3-10, 5-8 e 4-7. Dopo l’analisi 2D-PAGE con gel strip da 7 cm, abbiamo definito che il protocollo con acetone-TCA e i gel strip con range 4-7 sono i più adatti per Medicago sativa. Per poter avere una visione più completa del pattern proteico, in modo tale da poter analizzare il maggior numero di spot ottenibili dalla miscela proteica, sono poi stati utilizzati gel strip da 17 cm. Le analisi sono state condotte su tre campioni di piantine controllo (CNTRL) e su tre campioni di piantine sottoposte a stress termico (HS). Per ogni estratto proteico sono state effettuate tre analisi bidimensionali. Al fine di stabilire le differenze tra i pattern proteici dei campioni HS e CNTRL è stato necessario condurre una serie di analisi qualitative, quantitative ed anche combinate tra loro, con il software PD-Quest (BIO-RAD,versione 7.2). Al fine di identificare, spot significativamente differenti, alcuni di essi sono stati analizzati tramite spettrometria di massa. La ricerca in questo campo è ancora nella sua fase iniziale, soprattutto per quanto riguarda Medicago sativa. Il presente lavoro di tesi, sebbene limitato da difficoltà tecniche, ha pienamente dimostrato la potenzialità dell’approccio proteomico per l’identificazione e la successiva purificazione di proteine nel sistema in esame