ISOLAMENTO E CARATTERIZZAZIONE DEL GENE rx (retinal homeobox) IN PLANARIA

Basandosi sulla presenza di fondamentali differenze nella organizzazione strutturale e nell’ontogenesi, Salvini-Plawen e Mayr (1977) concludevano che gli occhi si erano evoluti indipendentemente almeno quaranta volte tra i vari gruppi animali. L’ipotesi di un’origine polifiletica dell’occhio ha riscosso incontrastata approvazione tra gli esperti di evoluzione fino a quando studi molecolari, basati sull’estesa conservazione del gene Pax6, hanno proposto la possibilità di un’origine monofiletica di queste strutture: questo di fatto ha riaperto il dibattito sull’origine degli occhi. Le cellule fotorecettrici possono essere distinte in due tipi principali: fotorecettori ciliari e fotorecettori rabdomerici. Questi due tipi cellulari presentano chiare differenze strutturali e molecolari. Generalmente gli occhi dei Vertebrati hanno fotorecettori ciliari, mentre la maggior parte degli invertebrati possiede fotorecettori rabdomerici. L’esatta funzione dei membri della famiglia genica retinal homeobox (rx) durante la formazione dei differenti tipi di occhi presenti nel mondo animale non è pienamente conosciuta. Un gran numero di evidenze suggerisce che questo gene è coinvolto con la proliferazione e la specificazione delle cellule progenitrici della retina, ed è cruciale per lo sviluppo dell’occhio in diverse specie di Vertebrati, come Xenopus, topo, pollo, medaka, zebrafish e uomo. Negli invertebrati, ad esempio in Drosophila, il gene Drx sembra non avere alcuna funzione correlabile con lo sviluppo degli occhi, ma è invece necessario per lo sviluppo del cervello e del clypeus, una struttura esoscheletrica presente nella porzione più anteriore della testa. Questi dati suggeriscono che il gene rx è essenziale per lo sviluppo dell’occhio dei Vertebrati, mentre lo sviluppo dell’occhio degli invertebrati è rx-indipendente. Ulteriori dati sulla funzione dei geni rx derivano da studi recenti condotti su Platynereis dumerilii (Anellide Polichete, Lofotrocozoi), un invertebrato dotato di entrambi i tipi di fotorecettori. In questo organismo il gene rx è espresso in fotorecettori ciliari che sono localizzati all’interno del cervello. La presenza di entrambi i tipi di fotorecettori in Platynereis è stata interpretata come una situazione ancestrale, che già esisteva in antenati dei Bilateri (Urbilateri). Le planarie (Platelminti, Tricladi), come P. dumerilii, appartengono ai Lofotrocozoi, un taxon ancora poco studiato da un punto di vista molecolare, ma considerato di particolare valore da un punto di vista evolutivo, perché fra i suoi membri sembrano essere particolarmente ben conservate caratteristiche considerate ancestrali. Durante il mio periodo di tesi, mi sono proposto di caratterizzare l’espressione e la funzione del gene rx nelle planarie, in modo da chiarire il ruolo di questo gene in questi organismi. Le planarie sono invertebrati noti per la loro straordinaria potenzialità rigenerativa, basata sulla formazione di un blastema ad opera di cellule staminali totipotenti (i neoblasti). Gli occhi di questi organismi sono strutturalmente semplici e sono considerati simili ad un ipotetico tipo ancestrale. Nel mio lavoro di tesi ho utilizzato due distinte specie di planarie, Dugesia japonica (Dj) e Schmidtea mediterranea (Smed). Ho isolato mediante RT-PCR un frammento del gene Djrx utilizzando primers specifici, scelti sulla base della sequenza presente in banca dati. Successivamente, ho ottenuto il gene Djrx completo tramite la tecnica 5’-RACE (rapid amplification of cDNA end). Recentemente è stato reso disponibile in banca dati il sequenziamento del genoma della planaria S. mediterranea, e questo mi ha permesso di ottenere “in silico” il gene completo in questa specie (Smedrx). Mediante esperimenti di ibridazione in situ “whole-mount”, condotti sia su planarie intatte che su planarie rigeneranti, ho analizzato l’espressione di questo gene in entrambe le specie. Una sonda ad RNA antisenso specifica per rx, marcata con digossigenina (DIG), prodotta mediante trascrizione in vitro, è stata utilizzata in questi esperimenti. I risultati mostrano chiaramente che, in planarie intatte, non è visibile alcun segnale di ibridazione. Sono stati condotti anche esperimenti di RT-PCR comparativa, in modo da definire l’espressione del gene Djrx lungo il corpo della planaria intatta. I risultati mostrano che, anche se Djrx è espresso maggiormente nella testa, un espressione basale è presente lungo tutto il corpo dell’animale. Durante la rigenerazione è possibile osservare la comparsa di due piccoli spot di ibridazione a livello del blastema anteriore, dove si sta formando il primordio del cervello. Allo scopo di studiare la funzione di questo gene, ho condotto esperimenti di perdita di funzione mediante la tecnica dell’RNA interference (RNAi). Iniettando molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) di rx in planarie rigeneranti la testa ed in planarie rigeneranti la coda, non ho osservato alcuna anomalia morfologica nel fenotipo. Al fine di verificare ad un livello più fine la presenza di possibili anomalie nelle strutture nervose, ho utilizzato marcatori molecolari del sistema nervoso, come la sinaptotagmina, mediante esperimenti di ibridazione in situ in planarie dopo rxRNAi e nei corrispondenti controlli, iniettati con acqua. I risultati ottenuti, sebbene preliminari sembrano evidenziare una diminuzione del numero delle cellule nervose che esprimono questo marcatore panneurale. Questi dati dovranno essere confermati mediante real-time RT PCR