Utilizzo dellla ibridizzazione sottrattiva soppressiva per isolare geni differenzialmente espressi nel cervello di ratto in seguito al trattamento con Acetil-L-Carnitina (ALC)

In questa tesi sperimentale sono state analizzate le azioni dell’Acetil-L-Carnitina (ALC), un metabolita fisiologico, a livello del Sistema Nervoso Centrale del vertebrato. Dati riportati in letteratura hanno dimostrato la validità delle applicazioni cliniche di ALC in pazienti affetti da Alzheimer da sindrome cronica da affaticamento, nell’ischemia , nell’invecchiamento e nelle neuropatie del dolore. Studi condotti a livello comportamentale su ratti anziani hanno evidenziato che tale molecola migliora l’apprendimento, l’attenzione e la memoria. Nell’Invertebrato Hirudo medicinalis, studi comportamentali hanno mostrato che ALC è in grado di influenzare processi di apprendimento di tipo non associativo e, in particolare, di bloccare la sensitizzazione e di ridurre la disabitudine nell’induzione al nuoto. Tali effetti permangono nel tempo suggerendo una possibile influenza di questa sostanza sull’espressione genica. Per verificare se ALC agisce attraverso modulazione dell’espressione genica, in questo lavoro sperimentale sono stati isolati geni differenzialmente espressi da cervelli di ratti giovani, ceppo Wistar, dopo 21 giorni di trattamento con iniezioni intraperitoneali di ALC (100 mg/Kg; gruppo sperimentale) rispetto a ratti trattati con una soluzione salina (0.9% NaCl; gruppo di controllo). Le variazioni nel pattern di espressione genica, prodotte dal trattamento con ALC, sono state evidenziate mediante l’ibridazione sottrattiva soppressiva, SSH (Suppression Subtractive Hybridisation).Tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA, questa tecnica è in grado di evidenziare le variazioni nell’espressione genica. Tale metodo risulta particolarmente efficiente nell’isolare anche i trascritti più rari o poco espressi, non evidenziabili tramite altre metodiche utilizzate per l’analisi di pattern di espressione genica. L’utilizzo dell’SSH ha permesso la costruzione di due librerie sottrattive, forward e reverse, costituite rispettivamente dai trascritti dei geni la cui espressione è modulata positivamente o negativamente dal trattamento con ALC. I cDNA di entrambe le librerie sono stati clonati. I cloni raccolti sono stati sottoposti ad uno screening primario mediante il quale sono stati selezionati i trascritti differenzialmente espressi in seguito al trattamento con ALC. Le sequenze dei cloni, ottenute con sequenziatore automatico, sono state analizzate e identificate tramite comparazione con sequenze depositate in GenBank, utilizzando software come FASTA e BLAST. Questa analisi ha permesso l’identificazione di alcuni geni che hanno mostrato un’elevata similarità con sequenze codificanti proteine note,quali la prostaglandina D2 sintetasi, la proteina integrale di membrana B2, la citocromo C ossidasi, la citosol perossidasi e la Nudix. L’analisi di espressione di alcuni cloni particolarmente interessanti, eseguita tramite RT-PCR relativa, ha confermato l’effettiva modulazione dei trascritti isolati in seguito a trattamento con ALC, confermando sia l’efficienza della tecnica SSH in questo tipo di analisi, sia la capacità di ALC di determinare modulazione dell’espressione genica