Allestimento di un saggio per la valutazione della risposta immunitaria cellulo-mediata nell'ambito di un protocollo di vaccinazione contro il virus dell'immunodeficienza felina

RIASSUNTO La vaccinazione si basa sulla stimolazione dei naturali meccanismi di difesa del sistema immunitario per generare resistenza nei confronti di vari agenti patogeni. La maggior parte dei vaccini attualmente in uso è in grado di evocare una risposta immunitaria soprattutto di tipo umorale. Tuttavia, nel caso di infezioni croniche endocellulari, come quelle causate da retrovirus, l’immunità cellulo-mediata è fondamentale al controllo dell’infezione ed al conferimento di una robusta immunità protettiva. I vaccini vivi attenuati si sono rivelati più efficaci nell’indurre l’attivazione delle cellule T citotossiche, ma una valida alternativa, emersa recentemente, è rappresentata dai vaccini a DNA, soprattutto se somministrati tramite un protocollo prime-boost, che combina un priming a DNA con un boost che utilizza un vettore ricombinante. Nel nostro laboratorio è in corso di sperimentazione un protocollo di vaccinazione di questo tipo contro il virus dell’immunodeficienza felina (FIV). Il prime consiste nella somministrazione di un plasmide a DNA esprimente env di FIV in combinazione con la citochina granulocyte macrophage colony stimulating factor felina (fGM-CSF), potente adiuvante naturale. Il boost, effettuato con lo scopo di potenziare proprio la risposta cellulo-mediata, consiste nella somministrazione di cellule dendritiche autologhe trasdotte in vitro con un vettore veicolante env e l’interleuchina 15 felina, la quale viene utilizzata per stimolare il differenziamento e la proliferazione delle cellule effettrici della risposta immunitaria. Lo scopo di questa tesi è l’allestimento di un saggio che ci permetta di valutare l’entità della risposta immunitaria cellulo-mediata indotta dal vaccino. Il saggio si basa sull’utilizzo di fibroblasti autologhi, che vengono trasformati in maniera da generare una linea stabile e vitale in coltura per lunghi periodi di tempo (anche dopo scongelamento). Le linee cellulari così prodotte vengono trasdotte stabilmente per esprimere l’antigene di interesse ed una proteina reporter, la green fluorescent protein (GFP), e vengono incubate con i peripheral blood mononuclear cells (PBMC) prelevati dall’animale vaccinato. Se i PBMC sono stati sensibilizzati efficacemente dalla vaccinazione, sono in grado di riconoscere l’antigene espresso dai fibroblasti e procedono alla loro lisi. Questa viene rilevata, dopo diversi tempi di incubazione, tramite analisi al citofluorimetro, il quale registra una diminuzione nel numero di fibroblasti fluorescenti. La percentuale di lisi ottenuta ci permette di valutare l’entità della risposta immunitaria cellulo-mediata sviluppata dall’animale vaccinato. Rispetto alle precedenti tecniche, questo saggio presenta numerosi vantaggi, tra i quali la facilità di applicazione, il basso costo e la bassa pericolosità, dal momento che non vengono impiegati reagenti radioattivi o tossici. Opportunamente modificato, il metodo è facilmente applicabile ad altri protocolli di vaccinazione e trasferibile all’uomo o ad altri modelli sperimentali