Regolazione dell'espressione delle importine nell'ippocampo e nella corteccia entorinale di ratto durante l'epilettogenesi.

L’epilessia è una delle malattia neurologiche più diffuse, ed è caratterizzata dalla ripetuta comparsa di crisi scatenate da una improvvisa ed eccessiva scarica elettrica che insorge a livello di specifiche aree cerebrali. A seconda delle aree colpite, le crisi possono essere di tipo molto diverso (convulsioni, allucinazioni sensoriali, perdita di coscienza…). L’epilessia dei lobi temporali è una delle forme più comuni e più gravi della malattia, che colpisce le strutture del sistema limbico situate nella regione temporale del cervello. Questo tipo di epilessia compare in seguito ad un evento scatenante (trauma cranico, ischemia cerebrale, convulsioni febbrili prolungate) che, dopo un lungo periodo di latenza nel quale non si verificano attacchi, porta all’insorgenza della malattia vera e propria, caratterizzata da crisi spontanee, sempre più gravi e frequenti, e spesso resistenti al trattamento farmacologico. E’ evidente quindi che lo studio dei meccanismi di epilettogenesi, cioè di quegli eventi che si verificano durante la fase di latenza e portano alla comparsa dell’epilessia cronica, è fondamentale per lo sviluppo di nuove ed efficaci terapie. Esperimenti condotti sull’uomo e in modelli animali suggeriscono che l’epilettogenesi sia caratterizzata da una serie di modificazioni molecolari, cellulari, anatomiche ed elettrofisiologiche a carico dei neuroni dell’ippocampo e della corteccia entorinale, che sono le strutture maggiormente colpite nell’epilessia dei lobi temporali. In particolare, si ipotizza che queste modificazioni siano dovute ad un’alterazione dell’espressione genica durante l’epilettogenesi. Studi molto recenti suggeriscono che nell’ippocampo, le proteine importine alfa e beta, che mediano il trasporto di altre proteine dal citoplasma al nucleo, svolgano un ruolo molto importante nella regolazione dell’espressione genica, in quanto responsabili del trasporto al nucleo di specifiche chinasi in grado di modificare la trascrizione di geni neuronali. Sulla base di queste considerazioni, durante il mio lavoro di tesi ho iniziato a caratterizzare l’espressione, la localizzazione ed il signaling delle importine nei neuroni dell’ippocampo e della corteccia entorinale durante l’epilettogenesi. Come modello sperimentale di epilettogenesi ho utilizzato la somministrazione sistemica di acido kainico (KA; 12mg/kg) in ratti maschi di 35 giorni di età. Nel ratto, infatti, una singola iniezione di KA induce rapidamente (1-4 ore) lo stato epilettico, seguito – dopo un periodo di latenza di circa 4 settimane – dalla comparsa dell’epilessia cronica caratterizzata da crisi spontanee ricorrenti. Mediante esperimenti di ibridazione in situ ed immunoistochimica su sezioni di cervello, ho analizzato l’espressione delle importine alfa1 e beta1 nell’ippocampo e nella corteccia entorinale di ratti di controllo, di ratti durante lo stato epilettico (ratti SE; 2-3 ore dopo la somministrazione di KA) e di ratti epilettici cronici (5 settimane dopo la somministrazione di KA). I risultati ottenuti dimostrano che l’espressione dell’importina alfa1 diminuisce nell’ippocampo (sia nei ratti SE che in quelli cronici) e nella corteccia entorinale (solamente nei ratti SE). Anche l’espressione dell’importina beta1 diminuisce sensibilmente sia nell’ippocampo che nella corteccia durante lo SE; tuttavia, a differenza della alfa1, essa aumenta nelle stesse strutture negli animali cronici. Inoltre, nei neuroni della corteccia entorinale, la localizzazione dell’importina beta1 sembra essere esclusivamente nucleare negli animali cronici, mentre negli animali SE ed in quelli di controllo sembra essere sia citoplasmatica che nucleare. Questo suggerisce che durante l’epilettogenesi, in questi neuroni, l’importina beta1 traslochi al nucleo. Studi condotti su neuroni del sistema nervoso periferico suggeriscono che la chinasi ERK, nella sua forma fosforilata (pERK), si complessi con l’importina beta1 per essere trasportata dall’assone al nucleo. Mediante esperimenti di doppia marcatura immunoistochimica ed analisi al microscopio confocale, ho studiato la co-localizzazione dell’importina beta1 e di pERK nell’ippocampo e nella corteccia entorinale di ratti SE, cronici e di controllo. I risultati ottenuti dimostrano che pERK e importina beta1 sono co-localizzati nei neuroni dell’ippocampo e della corteccia entorinale solo nei ratti SE, ma non in quelli cronici. Infine ho iniziato a caratterizzare i tipi cellulari nei quali l’espressione dell’importina beta1 viene regolata dall’attività epilettica. Esperimenti preliminari dimostrano che l’importina beta1 non viene sovraespressa né nella microglia né negli interneuroni positivi per il neuropeptide Y. Questi risultati dimostrano che l’attività epilettica, sia acuta che cronica, è in grado di modificare l’espressione delle importine alfa1 e beta1 nell’ippocampo e nella corteccia entorinale del ratto. Inoltre, l’interazione tra importina beta1 e pERK non sembra essere importante nel processo di epilettogenesi. Esperimenti futuri saranno mirati a caratterizzare in maniera dettagliata i tipi cellulari nei quali l’attività epilettica regola l’espressione delle importine, e ad identificare altri substrati diversi da pERK che interagiscano con le importine stesse