Effetti dell’esperienza visiva sulla regolazione della trascrizione genica in corteccia visiva durante il periodo critico e nell’adulto

In moltissime specie durante lo sviluppo post-natale esiste un periodo (chiamato periodo critico) in cui l’esperienza visiva ha un ruolo decisivo per la maturazione della corteccia visiva. Ad esempio, se si esegue una deprivazione monoculare durante il periodo critico, le risposte visive delle cellule corticali diventeranno gradualmente dominate dall’occhio non deprivato. Questo effetto della deprivazione monoculare non avviene se essa è eseguita dopo il periodo critico. E’ stato ipotizzato che l’esperienza visiva durante il periodo critico sia estremamente efficace nell’attivare processi cellulari che portano a fenomeni di plasticità sinaptica. Lo scopo di questa tesi è di studiare le vie di traduzione attivate dall’esperienza visiva durante il periodo critico e confrontarne l’attivazione negli animali adulti. Ci siamo focalizzati sulla via di ERK1,2 (p42/44 MAP chinasi), studiata per il suo coinvolgimento nei fenomeni di plasticità sinaptica, e su suoi possibili bersagli molecolari importanti per la regolazione della trascrizione genica e per il rimodellamento della cromatina. L’attivazione di questi fattori è stata analizzata in vivo mediante stimolazione visiva fisiologica di animali precedentemente allevati al buio per 3 giorni. Gli effetti della stimolazione sono stati valutati per mezzo di analisi immunoistochimiche con anticorpi specifici per la forma fosforilata di ERK, MSK, RSK e istone H3 su fettine di corteccia visiva di topi durante il periodo critico o adulti. Inoltre si sono utilizzati topi transgenici in cui l’espressione del gene per il marcatore b-galattosidasi era posta sotto il controllo esclusivo del fattore di trascrizione CREB (topi CRE-lacZ). L’analisi al microscopio confocale delle marcature in corteccia visiva binoculare ha mostrato un aumento di fosforilazione di ERK nei neuroni della corteccia visiva già 5 min dopo l’esposizione alla luce che raggiunge il picco massimo a 15 min per poi ritornare al livello basale a 40 min. L’esposizione alla luce attivava anche l’espressione della b-galattosidasi visualizzata con istochimica nei topi CRE-lacZ. L’attivazione dell’espressione genica mediata dal CREB non avveniva se ERK era bloccata, in corteccia visiva, per mezzo dell’infusione con l’inibitore di MEK (che fosforila ERK) UO126. Anche per un gene endogeno come c-fos si è notata un’attivazione a 40 min dopo l’esposizione alla luce in topi durante il periodo critico. L’attivazione di c-fos era attenuata dall’UO126 suggerendo che altre vie di traduzione possano concorrere all’attivazione visiva di questo fattore. Ripetendo quest’analisi nell’adulto abbiamo osservato che nonostante ERK mostri un’attivazione simile a quella del periodo critico, l’attivazione dell’espressione genica mediata dal CREB era ridotta sostanzialmente. Il c-fos, il cui promotore contiene altre sequenze regolatorie oltre al CREB, è attivato anche nell’adulto. Dato che CREB non è fosforilato direttamente da ERK abbiamo analizzato due chinasi, MSK e RSK, entrambe a valle di ERK e in grado di fosforilare CREB. Durante il periodo critico l’esperienza visiva non causa l’attivazione della chinasi RSK; al contrario la chinasi MSK durante il periodo critico si attiva con lo stesso decorso temporale di ERK ed è bloccata dall’UO126. Ulteriori analisi al confocale hanno rivelato che fosfo-ERK e fosfo-MSK colocalizzazano negli stessi neuroni corticali. Si può quindi proporre che MSK sia la CREB chinasi che media l’azione di ERK, mentre RSK potrebbe non essere coinvolta. Nell’adulto sembra esserci ancora un’attivazione di MSK, ma ancora i dati sono preliminari. Successivamente abbiamo studiato un possibile bersaglio di MSK, l’istone H3 la cui fosforilazione è implicata nel rimodellamento della cromatina per facilitare l’espressione genica. A tal fine abbiamo utilizzato un anticorpo specifico per l’istone H3 fosforilato nel sito riconosciuto da MSK. Durante il periodo critico, la fosforilazione dell’istone H3 indotta dall’esperienza visiva è duratura nel tempo essendo presente a 15 min dall’esposizione alla luce e rimanendo invariata a 40 min. Questa fosforilazione dipende da ERK in quanto l’inibitore di ERK UO126 inibisce la fosforilazione dell’istone H3 indotta dall’esperienza visiva. Nel rimodellamento della cromatina potrebbe essere implicata anche l’acetilazione degli istoni H3 e H4, ma su questo abbiamo dei dati non ancora conclusivi. Nell’adulto abbiamo osservato un decorso temporale diverso: la fosforilazione dell’istone H3 è transiente con un picco a 15 min dopo l’esposizione alla luce, che ritorna ai valori di base già dopo 40 minuti. I dati suggeriscono che una regolazione differenziale della trascrizione genica e del rimodellamento della cromatina dipendente dall’esperienza visiva sia coinvolta nella variazione delle capacità plastiche dei circuiti corticali che avvengono in coincidenza con il termine del periodo critico