Costruzione di librerie sottrattive di cDNA dal sistema nervoso di Hirudo medicinalis dopo trattamento con Acetil-L-Carnitina.

Questo lavoro fa parte di un progetto di ricerca finalizzato a valutare gli effetti di una molecola naturale, la Acetil-L-Carnitina (ALC), sul sistema nervoso di un invertebrato, la sanguisuga Hirudo medicinalis. Da esperimenti condotti nei nostri laboratori è emerso che una singola somministrazione di ALC influenza forme di apprendimento non associativo. In particolare l’ALC si è dimostrata in grado di bloccare la sensitizzazione e di ridurre la disabitudine nell’induzione al nuoto di Hirudo medicinalis. Tali effetti si esplicano già dopo 2 ore dal trattamento e si mantengono fino ad 11 giorni dalla singola somministrazione della sostanza. Il fatto che la ALC abbia effetti così duraturi nel tempo ha portato a pensare che ci sia un aumento della sintesi proteica nel sistema nervoso della sanguisuga in seguito al trattamento. Per valutare le eventuali modifiche del pattern di espressione genica, è stata applicata la tecnica della ibridazione sottrattiva soppressiva o SSH (Suppression Subtractive Hybridisation), utilizzando il PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit (BD Biosciences, Clontech). Questa tecnica permette di identificare geni la cui espressione può essere indotta o inibita dal trattamento in esame, tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA. In particolare, l’efficienza di questa tecnica sta nella capacità di isolare anche i trascritti più rari, non identificabili con l’utilizzo di altre tecniche di analisi di pattern di espressione genica. Un gruppo di animali è stato sottoposto a una iniezione con soluzione fisiologica (gruppo di controllo), mentre un secondo pool di sanguisughe è stato iniettato con ALC 2mM (gruppo sperimentale). Trascorsi 11 giorni dal trattamento, sono state estratte le catene gangliari dagli animali sperimentali e di controllo e, utilizzando il protocollo del gradiente di CsCl, è stato isolato l’RNA totale. Vista l’esigua quantità di RNA totale estratto, è stato utilizzato il BD SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit (BD Biosciences, Clontech), mediante il quale è stato possibile ottenere e amplificare il cDNA. L’utilizzo del PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit ha portato alla costruzione di due librerie sottrattive di cDNA, forward e reverse, costituite, rispettivamente, dai trascritti attivati in seguito alla somministrazione con ALC, e dai trascritti modulati negativamente dallo stesso trattamento. I cDNA ottenuti sono stati clonati e sottoposti a screening; lo screening è tuttora in corso. Il sequenziamento dei cloni differenziali e la loro successiva identificazione utilizzando le banche dati presenti in rete, mostrerà le modificazioni nell’espressione genica a livello del sistema nervoso associate al trattamento con ALC