CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DEL RECETTORE ETERODIMERICO D2/D3 DELLA DOPAMINA CON FARMACI ANTIPARKINSONIANI

RIASSUNTO I recettori accoppiati a proteine G (G-protein-coupled receptor o GPCRs) rappresentano il sistema di trasduzione del segnale più diffuso nel regno animale e sono uno dei maggior bersagli in campo farmacologico. Negli ultimi anni studi biofisici e farmacologici hanno dimostrato l’esistenza di complessi recettoriali omodimerici ed eterodimerici, proponendo affascinanti possibilità combinatoriali nel sistema di trasduzione del segnale e fornendo un nuovo punto di partenza per la ricerca di sostanze terapeutiche. I recettori dopaminergici appartengono alla famiglia dei GPCRs; è stato dimostrato che essi esistono nei sistemi cellulari sia come omodimeri che come oligomeri, inoltre, recentemente sono state fornite evidenze di eterodimerizzazione tra il recettore dopaminergico D1 e quello per l’adenosina A1, così come tra il recettore dopaminergico D2 e quello per la somatostatina SSTR5. Alterazioni nel sistema dopaminergico sono presenti nel morbo di Parkinson, nelle psicosi e nei disordini mentali legati all’abuso di sostanze, ed è per questo che i recettori dopaminergici rappresentano un bersaglio importante per la terapia farmacologica di queste patologie. Molti agenti farmacologici, usati nel morbo di Parkinson e nelle psicosi, interagiscono in particolare con i recettori dopaminergici D2 e D3 appartenenti alla sottofamiglia D2-like. Il recettore dopaminergico D3 ha un’affinità per la dopamina, e per molti agonisti dopaminergici, più elevata rispetto al recettore D2; tuttavia il suo accoppiamento con la proteina G è più debole rispetto al recettore D2 che risulta invece potentemente accoppiato a queste proteine e quindi molto attivo. I recettori D2 e D3 hanno un alto grado di omologia nella loro sequenza aminoacidica e sono spesso co-espressi nei tessuti nativi. Queste considerazioni ci hanno suggerito di studiare la possibilità che i recettori D2 e D3 interagiscano funzionalmente formando recettori eterodimerici che combinano le caratteristiche farmacologiche e funzionali dei due recettori. Un probabile modo di dimerizzazione è il “domain-swapping” dove un riarrangiamento crea due nuovi siti di legame che differiscono sostanzialmente da quelli dei rispettivi monomeri. Questo tipo di interazione è stato originariamente proposto per spiegare la dimerizzazione tra due recettori chimerici inattivi. In particolare partendo dal recettore a2 adrenergico e M3 muscarinico sono state costruite due chimere recettoriali chiamate a2/M3 e M3/a2, in cui il dominio carbossi-terminale dei due recettori a2 adrenergico e M3 muscarinico è stato scambiato reciprocamente. Mentre nessuna delle due chimere a2/M3 e M3/a2 era capace di legare i vari composti adrenergici e muscarinici e di attivare il secondo messaggero, quando venivano co-espresse nelle stesse cellule era possibile rilevare la presenza di ambedue i recettori wild type a2 adrenergico e M3 muscarinico, a dimostrazione di una avvenuta interazione tra le due chimere con scambio dei propri domini. Per i nostri esperimenti, inizialmente abbiamo preparato dei frammenti recettoriali tagliando il D2 e il D3 a livello del terzo loop citoplasmatico, e ottenendo così quattro frammenti: D2-trunk, D2-tail, D3-trunk e D3-tail. Mentre i frammenti trunk erano formati dalle prime cinque regioni transmembrana dei recettori D2 e D3, i frammenti tail erano formati dalle ultime due. In questo lavoro, l’azione degli agenti antiparkinsoniani, S32504, ropinirolo e pramipexolo sull’eterodimeri D2/D3 è stata confrontata con quella sui rispettivi monomeri e sui recettori chimerici frammentati D2-trunk/D3-tail e D3-trunk/D2-tail. In studi di binding con l’antagonista [3H]nemonapride, tutti gli agonisti si sono mostrati potenti ligandi verso il recettore D3. Il rapporto di affinità tra il recettore D3 e D2 è stato rispettivamente di 100, 18, 56 volte verso i recettori D2, mimando l’azione del S33084 (100 volte), antagonista selettivo dei D3. Il pergolide invece ha mostrato solo una leggera preferenza per il D3 rispetto al D2L. Ad eccezione del ropinirolo che ha mostrato una leggera preferenza per il recettore D3-trunk/D2-tail, gli altri agonisti hanno mostrato un’affinità intermedia tra D2 e D3 per i recettori chimerici frammentati, ad eccezione del ropinirolo, tutti i ligandi hanno mostrato una più bassa affinità rispetto ai D3, mentre per i recettori D2-trunk/D3-tail l’affinità era più alta che verso i D2, compreso il ropinirolo. Nelle membrane derivate da cellule che co-esprimono i recettori D2 e D3, le percentuali di siti di legame ad alta affinità riscontrate con il S32504, ropinirolo e pramipexolo sono state più alte che nelle membrane derivate da cellule che esprimevano separatamente i recettori D2 e D3 e dopo mischiate. Questo aumento è verosimilmente dovuto alla formazione dell’eterodimero D2/D3. Infine, sono stati eseguiti studi funzionali co-trasfettando i recettori dopaminergici D2/D3 con un’adenilato ciclasi chimerica (AC-V/VI) insensibile ai recettori D3. Nelle cellule co-trasfettate con i recettori D2 e D3, S32504, ropinirolo e pramipexolo hanno inibito l’attività dell’AC-V/VI con una potenza rispettivamente di 33, 19, e 11 volte più alta rispetto a cellule trasfettate con il solo recettore D2L. Inoltre S32504 ha inibito l’attività dell’AC-V/VI anche in cellule co-trasfettate con i recettori chimerici frammentati D2-trunk/D3-tail e D3-trunk/D2-tail. In conclusione, in questo lavoro è stata dimostrata una differenza farmacologica quando gli agonisti venivano testati su recettori D2L o su recettori co-trasfettati D2/D3