Estudio de la Iduronato 2 Sulfato Sulfatasa en Escherichia Coli y Pichia pastoris.

Con el prop\uf3sito de mejorar las condiciones de expresi\uf3n y purificaci\uf3n de la lDShr expresada en P. pastoris GS1I5 pPTC9-IDS/28 y E. coli pUC 13-IDS/28 se adelant\uf3 el presente trabajo que contempl\uf3 una parte experimental y otra computacional. Con relaci\uf3n a la parte experimental se emple\uf3 como m\ue9todo de detecci\uf3n de la lDShr una prueba fluorom\ue9trica con el uso del sustrato MU-cIdoA-2S, que permiti\uf3 comprobar que la lDShr expresada en esos modelos biol\uf3gicos era activa. Empleando como ant\uedgeno IDShr purificada y donada por TKT, se obtuvo en conejos un anticuerpo policlonal anti-IDShr, el cual fue empleado para la elaboraci\uf3n de una columna de afinidad, usada durante el proceso de purificaci\uf3n. Se realizaron 20 cultivos P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 a nivel de biorreactor con vol\ufamenes de trabajo de 1.0 a 3.0 litros. Los cultivos fueron centrifugados y los sobrenadantes sometidos a ultrafiltraci\uf3n empleando secuencialmente membranas para exclusi\uf3n de mol\ue9culas de 100 y 30 KDa. Los retentados de esta manera obtenidos fueron corridos en cromatograf\ueda de exclusi\uf3n molecular y los picos con actividad IDShr se sometieron a cromatografia de afinidad. Las fracciones obtenidas con un nivel de siete purificaciones y menos del 2% de recuperaci\uf3n mostraron actividades enzim\ue1ticas hasta de 58,78 nmol/h/mg de prote\uedna, es decir, m\ue1s de 4 y 9 veces los valores de referencia del laboratorio del IEIM para la IDSh plasm\ue1tica y leucocitos. Sin embargo, estos valores no cumplen las expectativas para la producci\uf3n de la enzima recombinante en cantidades cl\uednicamente \ufatiles. La cuantificaci\uf3n de IDShr por ELISA, mostr\uf3 que menos del 1% corresponde a lDShr. Lo anterior demuestra que el nivel de expresi\uf3n en E. pastoris fue bajo. Igualmente en E. coli pUC 13-IDS/28 los niveles de actividad y expresi\uf3n fueron bajos. En los dos casos m\ue1s del 60% de las prote\uednas totales se encontraron en el ultrafiltrado final (menor a 30 KDa) y presentaron actividad IDShr, lo cual posiblemente se deba a actividad proteol\uedtica que genera fragmentos que mantienen parte del sitio activo y pueden presentar actividad enzim\ue1tica En busca de mejorar el sistema de expresi\uf3n fue donado el cDNA de la IDSh empleando el pl\ue1smido de expresi\uf3n pGEX 3X y se expres\uf3 la IDShr en E. coli JMIO9 bajo el sistema GST, logr\ue1ndose obtener 17.28 ng de IDShr/mg de prote\uedna, el paso siguiente lo constituye la purificaci\uf3n de la enzima por cromatografia de afinidad. El an\ue1lisis computacional permiti\uf3 la obtenci\uf3n de informaci\uf3n de la IDSh acerca de sus perfiles de hidrofobicidad, flexibilidad, accesibilidad y antigenicidad, punto isoel\ue9ctrico, peso molecular, Sitios potenciales de fosforilaci\uf3n, O y N-glicosilaci\uf3n, prints, bloques y alineamientos con otras mol\ue9culas con similaridades a la IDSh. Esta informaci\uf3n fue empleada para la elaboraci\uf3n de modelos computacionales de predicci\uf3n de las estructuras secundaria, terciaria y sitio activo. El modelo de estructura terciaria permiti\uf3 el dise\uf1o exitoso de p\ue9ptidos espec\uedficos para la producci\uf3n de anticuerpos IgY anti-IDShr. Se logr\uf3 establecer que el constructo pPIC 9-IDS/28 contiene los 25 residuos del p\ue9ptido se\uf1al y los 8 amino\ue1cidos del prop\ue9ptido. Estos residuos debieron ser eliminados, pues el constructo contiene la se\uf1al de secreci\uf3n u-MF, constituyen una zona altamente hidrof\uf3bica que cubre la entrada al bolsillo que contiene los amino\ue1cidos que constituyen el sitio activo. Lo anterior permite explicar los bajos niveles de expresi\uf3n de IDShr, dado que esos residuos adicionales deben alterar la conformaci\uf3n de la enzima recombinante con consecuencias directas en su plegamiento. Al no encontrarse correctamente plegada la prote\uedna es retenida, no puede abandonar el ret\uedculo endopl\ue1smico y es factible que se degrade a nivel de los proteosomas. Se usaron c\ue9lulas deP. pastors y se encontraron intracelularmente actividades hasta de 4.24 nmol/h/mg de prote\uedna, en un cultivo que en los sobrenadantes hab\ueda sido detectada actividad IDShr de 3.25 nmol/h/mg. Algunas mol\ue9culas pueden escapar al sistema de control y son secretadas. Dos o m\ue1s de estas mol\ue9culas pueden asociarse por las regiones hidrof\uf3bicas y este tipo de asociaciones explican la presencia, en Westem blot de sobrenadantes, de bandas correspondientes a pesos aproximados a 120 KDa. El an\ue1lisis de las mutaciones puntuales asociadas al modelo de estructura terciaria permiti\uf3 contribuir al establecimiento de una relaci\uf3n genotipo-severidad de la enfermedad