The DNA repair system in Pseudomonas aeruginosa: molecular characterization and natural occurrence of mutants

A infecção pulmonar é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). O prognóstico destes pacientes é influenciado pelo número de exacerbações anuais e a carga microbiana nas secreções respiratórias. Pseudomonas aeruginosa é o principal patógeno, tanto em importância quanto em prevalência. Recentemente, foi demonstrada a ocorrência de cepas de P. aeruginosa altamente transmissíveis em centros de atendimento a pacientes com FC. A persistência de P. aeruginosa no pulmão de pacientes com FC está associada, em parte, à presença de cepas com hipermutabilidade (HPM), um fenômeno decorrente, principalmente, de defeitos em genes envolvidos no sistema de reparo do DNA. Tivemos como objetivo investigar a ocorrência de cepas HPM em P. aeruginosa, associadas às infecções pulmonares crônicas em pacientes com FC, bem como, avaliar a associação entre HPM, resistência a antimicrobianos e expressão de fatores de virulência. Das 179 amostras bacterianas estudadas, isoladas de 17 (85%) dos 20 pacientes incluídos no estudo, 43 (24%) apresentaram HPM seguindo os critérios estabelecidos por Maciá e colaboradores. Essas subpopulações apresentaram maiores taxas de resistência a antimicrobianos. As amostras estudadas apresentaram grande variabilidade genética (49 perfis definidos com a utilização da técnica de RADP), embora tenha sido observada, também, a incidência de clones compartilhados por diferentes pacientes. Não encontramos similaridade entre os clones estudados e as cepas epidêmicas circulantes em outros países. Das amostras classificadas como HPM pelos critérios de Macia e colaboradores, apenas 3 delas apresentaram frequência de mutação que permitisse sua classificação como HPM. Com o sequenciamento do DNA encontramos mutações que levaram a mudança de aminoácidos nas proteínas codificadas pelos genes mutS, mutD e urvD. Não observamos mutações nos genes mutM, mutT e mutY que pudessem alterar os aminoácidos sintetizados. Como são escassos estudos sobre a influência da HPM em alterações fenotípicas outras que a resistência a antimicrobianos, comparamos a expressão de atributos de virulência nas populações selvagens e subpopulações. Não observamos alterações nos estados nutricionais, mobilidade e capacidade de formação de biofilme dos microrganismos estudados. Ao contrário, as subpopulaçãoes apresentaram uma menor atividade de LasA e um aumento na produção de piocianina, o que reforça nossa hipótese de que células mutantes teriam uma vantagem no ambiente pulmonar de pacientes com FC. Devido à diferença nos testes propostos para caracterização de HPM, sugerimos que o teste de difusão em agar modificado seja adotado como uma metodologia de triagem a ser utilizada em laboratório de microbiologia clinica.Pulmonary infection is a major cause of morbidity and mortality in patients with Cystic Fibrosis (CF). The prognosis of these patients is influenced by the number of annual exacerbations of the infectious processes and the microbial load in their respiratory secretions. Pseudomonas aeruginosa is the main CF pathogen, both in importance and predominance. Recently, highly transmissible P. aeruginosa strains were reported among CF patients from different CF Health Care centers. The persistence of P. aeruginosa in the lung of CF patients is associated, at leat in part, with the presence of strains with hipermutability (HPM), a phenomenon caused mainly by defects in genes involved in the DNA repair system. In this report, 43 (24%) out of 179 P. aeruginosa isolates recovered from 17 (85%) out of 20 CF patients included in the study were characterized as HPM, according to the criteria established by Maciá and collegues. The HPM subpopulations exhibited higher rates of antimicrobial resistance. By using the RAPD technique, bacteria included in our study were shown to exhibit high genetic variability and could be grouped in 49 different clones. However, a few clones were shared by different patients. No similarity was detected among these clones and epidemic strains from others countries. Of the 43 isolates classified as HPM by Maciás criteria, only 3 exhibited mutation frequencies allowing their inclusion in the HPM group. By sequencing the DNA from these bacteria we found mutations in the genes mutS, mutD and urvD that resulted in changes in the aminoacids sequences. We did not observe mutations in the genes mutM, mutt and mutY that could have altered the aminoacid sequence from synthesized protein. Since there are only a few report in the literature on the influence of HPM on bacterial phenotypic alterations other than antimicrobial resistance, we also compared 81 bacterial isolates from the wild populations and HPM subpopulations in their virulence properties No difference among the microorganisms were detected considering their nutricional variations, mobility and ability of biofilm formation. In contrast, HPM subpopulations exhibited decreased LasA activity and increased production of pyocianyn. These results reinforced our hypothesis that bacterial mutants may have some advantage in the pulmonary environment of CF patients. Due to the difference in the results of the two sorts of test used to identify HPM, we propose the test of diffusion in modified agar as a trial test to be included in laboratories of clinical microbiology