Validierung einer neuen Messmethode zur direkten Bestimmung der Heparin-Konzentration im Blut

In dieser Arbeit wurde ein neues Verfahren zur Heparin-Bestimmung (LiSA-H, light scattering assay of heparin) evaluiert. Dieses wurde an der Universität Frankfurt a. M. am Institut für Biophysik entwickelt und ermittelt erstmals die direkte Heparin-Konzentration im Blutplasma. Durch die Analyse der Lichtstreuung einer Plasmaprobe wird die Bildung von Nanopartikeln aus Heparin und Protamin verfolgt. Die Lichtstreuintensität ist dabei proportional zu der in der Probe enthaltenen Heparin-Plasmakonzentration (Heparin-PK). Das Antikoagulans Heparin wird bei Herz-OPs mit Einsatz der Herz-Lungen-Maschine (HLM) verwendet und soll perioperativ eine lutgerinnselbildung in der HLM, sowie Thromboembolien im Patienten verhindern. Am OP-Ende wird die Wirkung durch Protamin antagonisiert, um eine suffiziente Gerinnung wieder herzustellen. Das derzeitige Gerinnungsmanagement basiert auf einem indirekten Messverfahren, der ACT (activated clotting time), welches starken Störeinflüssen, wie z.B. der Hypothermie, Hämodilution und bestimmten Medikamenten unterliegt. Durch die mögliche Falschdosierung der beiden Medikamente, steigt die Gefahr einer Blutung und Thrombose. LiSA-H soll in Zukunft eine zuverlässigere und kostengünstige „point of care― Analyse der Gerinnung und hierdurch eine gezielte Dosierung von Heparin und Protamin ermöglichen, die die Komplikationsrate verringert. In der vorliegenden Studie handelt es sich um eine offene, nicht kontrollierte, prospektive Multicenter-Studie, die mit 50 Patienten am Universitätsklinikum Frankfurt a.M. und 30 Patienten am Kinderherzzentrum Gießen durchgeführt wurde. Es wurde gezeigt, dass die durchschnittliche perioperative Heparin-PK bei Erwachsenen und Kindern bei ca. 5,4 I.E./ml liegt. Es wurde nachgewiesen, dass die Heparin-Clearance bei Kindern (~113 Min.) um das zweifache im Vergleich zu Erwachsenen (~254 Min.), erhöht ist. Besonders hervorzuheben ist die hohe Fehlerquote der ACT-Messung, die bei Erwachsenen in bis zu 1,8 % und bei Kindern in bis zu 20 % der Messungen keinen aussagekräftigen Wert lieferte. Das bedeutet, dass bei Kindern während einer OP bis zu zwei und bei Erwachsenen bis zu drei Stunden keine Information über den aktuellen Gerinnungszustand vorlag. Um eine Validierung der Messergebnisse vorzunehmen, wurden Rückstellproben mit dem Standardlaborverfahren PiCT (Prothrombinase induced clotting time) gemessen. Die Daten aus dem PiCT korrelieren mit den Ergebnissen aus der LiSA-H-Messung wesentlich besser (r² = 0,80), als mit der herkömmlichen ACT-Messmethode (r² = 0,57). Die ermittelten Heparin-PK und die ACT-Werte während einer OP wurden in Chronogrammen dargestellt. Es wurde gezeigt, dass in 30 % der OPs bei Erwachsenen und in 60 % bei Kindern die Messdaten aus der ACT und LiSA-H nur unzureichend synchron bei Nachdosierung mit Heparin anstiegen oder entsprechend der Heparin-Clearance im OP-Verlauf abfielen. Dies zeigte sich besonders kritisch während langandauernder, komplikationsreicher OPs, die einen erhöhten Blutverlust oder sogar Rethorakotomien nach sich zogen, in denen der ACT-Wert eine suffiziente Gerinnung nahe legte, die LiSA-HMessung aber eine noch hohe Heparin-PK nachwies. Erfahrungen aus den klinischen Studien zeigten, dass die Kombination aus der Messung der Heparin-PK und einer Gerinnungsanalyse bei einem ATIII-Mangel von Vorteil ist. Erst die Kombination aus einerseits mehrfach niedrig gemessener ACT-Werte, trotz ggf. Nachdosierungen von Heparin und andererseits ausreichend gemessener Heparin-PK im LiSA-H, kann einen ATIII-Mangelzustand aufdecken. Dadurch können Nach- bzw. Überdosierungen vermieden und damit die Wahrscheinlichkeit für postoperative Komplikationen verringert werden. Der wichtigste Einflussfaktor auf die LiSA-H-Messung ist die Hämodilution, die durch Einbeziehung des Patienten-Blutvolumens (z.B. mit der Nadler-Formel) durch mathematische Korrektur berücksichtigt werden kann. Patientenindividuelle Reaktionen auf gleiche Heparin- und Protamin-Dosierungen sowie eine patientenspezifische Heparin-Clearance zeigten in diesen Studien auf, dass das derzeitige Antikoagulationsmanagement mit den Dosierungsempfehlungen (Körpergewichtsbezogene Dosierung, 1:1 Dosierung von Protamin zur initialen Heparin-Dosis oder der summierten Heparin-Dosis, „pauschale― Nachdosierungen von 5.000 oder 10.000 I.E. Heparin bei ACT < 480) für eine optimale Dosierung der Medikamente unzureichend ist. In Outcome-Studien soll mit der LiSA-H-Messung Dosierungsempfehlungen von Heparin und Protamin ausgearbeitet werden. Außerhalb der Herz-Thorax-Chirurgie eröffnen sich weitere Möglichkeiten, wie z.B. in Dialysezentren und in der Neurochirurgie, für die bereits Studien geplant sind.In this thesis a new method for the determination of heparin (LiSA-H - light scattering assay of heparin) is evaluated. This new measuring method, which was developed by the Institute of Biophysics, University Frankfurt (Main), for the first time quantifies a direct heparin concentration in the plasma. By analyzing the light scattering of a plasma sample, the formation of heparin and protamine nanoparticles can be tracked. In this process, the light scattering intensity is a function of the heparin plasma concentration in the sample. The anticoagulant drug heparin is administered, inter alia, in cardiac surgery using heart-lung machines to prevent both the formation of blood clots in the machine and thromboembolism in the patient’s body. At the end of the operation, protamine is given to neutralize the anticoagulation effect of heparin and to restore normal blood coagulation. The current coagulation management is based on an indirect measuring procedure called ACT (activated clotting time) that is influenced by various parameters such as hypothermia, haemodilution and certain drugs used in the treatment. Thus, additionally to surgical risks, incorrect dosing of heparin and its antagonist protamine increases the danger of bleeding and thrombosis. In the future LiSA-H can provide a more reliable and cost-effective point of care analysis of coagulation and an exact dosing of heparin and protamine which can lead to a lower number of postoperative complication rates. The study presented here was an open-label, non-controlled, prospective multicenter trial that involved 50 patients at University Hospital Frankfurt/Main and 30 patients at Children’s Heart Center Giessen. It was shown that the average perioperative plasma concentration of heparin in adults and children was approximately 5,4 I.U./ml. It was also demonstrated that the heparin clearance in children (~113 minutes) was two times higher than in adults (~254 minutes). It is important to stress the high probability of error of the ACT measurement. It did not provide significant values in up to 1.8% of the adults and in up to 20% of the children. This means that there is not any information on the perioperative coagulation status available for children for up to two hours and for adults for even up to three hours during surgery. To validate the results, retained plasma samples were quantified using the standard laboratory method prothrombinase-induced clotting time (PiCT). The PiCT data correlate much better with the results of the LiSA-H measurement (r2=0.80) than with the conventional measurement of ACT (r2=0.57). The measured heparin plasma concentrations and the ACT values during surgery can be displayed in chronograms. It could be shown that during 30% of the operations in adults and during 60% of the operations in children the measured ACT and LiSA-H data did not rise and decay synchronously, but developed independently. It became especially critical during partly difficult and prolonged operations that resulted in an increased blood loss or even rethoracotomies. During these ones ACT analyzed an adequate coagulation but the LiSA-H measurement detected a still high plasma concentration of heparin, a probable cause of the problem. The experience gathered in the clinical studies showed that the combination of the measurement of plasma heparin level and a coagulation determination would be advantageous in the event of a low antithrombin III-level. Only the combination of ACT values which were repeatedly low despite of redosing heparin on the one hand and sufficient plasma heparin concentration in LiSA-H on the other can detect an ATIII deficiency. Thus, unnecessary redosing or overdosing that increases the probability of postoperative complications can be avoided. The most significant influencing factor on the LiSA-H measurement is haemodilution. In the future, it will be considered by inclusion of the patient’s blood volume (e.g. a calculation based on Nadler method). The individual reactions of the patients to the same heparin and protamine dosing and a patient-specific heparin clearance demonstrated in these studies that the current anticoagulation management and its dosage recommendations and "rules of thumb― (for example standardized dosage that relates the body weight, 1:1 dosing of protamine for the initial heparin dose or the total heparin dose, "across-theboard―redosing of 5,000 or 10,000 I.U. heparin at ACT < 480) are insufficient for an optimal dosing of anti-/coagulants. With the help of LiSA-H, dosage recommendations of heparin and protamine will be developed in further outcome studies. In addition to cardiothoratic surgery further fields of application will be opened up, e.g., in dialyses facilities and in neurosurgery for which studies have already been planned