Functional characterization of the Jumonji C domain-containing protein 6 (Jmjd6) in the vascular system

Conclusion: Proteins containing a Jumonji C (JmjC) domain appear in almost all living organisms and catalyze a variety of oxidation reactions. Therefore, they are important regulators in many biological processes such as proliferation and differentiation. They act either as protein hydroxylases, histone demethylases or by regulate mRNA splicing. Given the fact that some of the JmjC domain-containing proteins are shown to be upregulated in response to hypoxia as well as the dependency of JmjC domain catalytic activity on oxygen led to the assumption of an involvement in angiogenesis. For Jmjd6, a member of the JmjC domain-containing protein family, a regulatory involvement in mRNA splicing has been shown. The Jmjd6-/- mouse dies perinatally due to several severe organ malformations, especially in the heart. Despite the pale appearance, the growth retardation and the cardiac defects, it is unclear whether these mice exhibit defects of cells comprising the vasculature. Therefore, the involvement of Jmjd6 in angiogenesis was examined in vitro using angiogenesis assays as well as in vivo using the Jmjd6+/- mouse. An siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs significantly impaired the formation of capillary-like networks in the tube formation assay as well as sprouting in the spheroid assay. Moreover, after siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs cell migration was significantly reduced. These findings were confirmed in the matrigel plug assay in vivo. Implanted matrigel plugs of Jmjd6+/- mice exhibited significantly less perfused vessels compared to wildtype littermates. Furthermore, cultured lung ECs from Jmjd6+/- mice exhibited impaired network forming activity ex vivo compared to cells isolated from wildtype littermates. To elucidate the mechanisms underlying the requirement of Jmjd6 in angiogenesis, an Affymetrix exon-array was performed, which allows detection of changes in gene expression as well as splicing. The siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 altered the expression of genes known to play a role in vascular biology. The bioinformatic assessment of alternative splice variants revealed that Jmjd6 silencing affects the splicing of the VEGF receptor 1 (Flt1). Differential splicing of Flt1 was shown to generate a short and soluble form of Flt1 (sFlt1), which sequestrates VEGF and PlGF, and thereby inhibits angiogenesis. In particular, a significant increase in sFlt1 expression was observed. Jmjd6 was recently reported to hydroxylate the splicing factor U2AF65. Therefore, we investigated whether U2AF65 might mediate Flt1 splicing and binds to Flt1 mRNA. Indeed, U2AF65 co-immunoprecipitated with Jmjd6 in ECs, while an interaction of U2AF65 with sFlt1 was demonstrated. Moreover, inhibition of Jmjd6 catalytic function by reduced oxygen concentration altered splicing of Flt1 resulted in an increase of the sFlt1 splice variant. Finally, saturating concentrations of VEGF or PlGF or neutralizing antibodies against sFlt1 significantly reduced the inhibition of sprouting caused by Jmjd6 knockdown in vitro. Collectively, our results indicate that Jmjd6 has an essential role in the oxygen-dependent regulation of angiogenesis by controlling the splicing of Flt1 mRNA, thereby adjusting the generation of the anti-angiogenic short splice variant sFlt1. Several publications demonstrated a major importance for sFlt1 as a biomarker for many severe human diseases such as preeclampsia, sepsis, cancer, myocardial infarction as well as chronic heart failure. Therefore, the identification of the molecular mechanism behind the generation of sFlt1 might enable the development of new or more precise clinical markers for the diagnosis of the corresponding diseases. Furthermore, the discovery of the enzymes involved in the generation of sFlt1 provides further possibilities to modulate sFlt1 levels and thereby may potentially gives rise to the development of new therapies.Proteine, die eine JmjC-Domäne enthalten, gehören zu einer evolutionär hochkonservierten Familie von Oxygenasen. Aufgrund ihres evolutionär frühen Entstehens konnten Mitglieder dieser Proteinfamilie in einer Vielzahl von Lebewesen nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass Proteine mit einer JmjC-Domäne als Regulatoren von wichtigen biologischen Prozessen agieren, zum Beispiel in der Zellproliferation und in der Zelldifferenzierung während der embryonalen Entwicklung. Die enzymatische Reaktion, die von der JmjC Domäne katalysiert wird, benötigt zweiwertiges Eisen (Fe(II)), Oxoglutarat und Sauerstoff als Kofaktoren. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie katalysieren eine Vielzahl von enzymatischen Reaktionen, wie Protein-Hydroxylierung, Protein-Demethylierung und DNA-Reparaturprozesse. Eine Beteiligung von Jmjd6 konnte bis jetzt bei zwei enzymatischen Reaktionen nachgewiesen werden. Zum einen hydroxyliert Jmjd6 posttranslational Proteine, die direkt am mRNA Spleißen beteiligt sind und agiert dadurch als Regulator des alternativen Spleißen spezifischer mRNAs, zum anderen wurde eine Demethylierung von zwei spezifischen Histon-Argininen durch Jmjd6 nachgewiesen. Die Jmjd6-/- Mäuse haben ein anämisches Erscheinungsbild, sind wachstumsretardiert und weisen sowohl schwerwiegende subkutane Ödeme als auch eine Vielzahl von Differenzierungsdefekten und Organmissbildungen auf. Letztere sind vor allem im Gehirn, den Nieren, der Leber, den Augen und dem Herzen zu beobachten. Aufgrund der kardialen Fehlbildungen sterben die Jmjd6-/- Mäuse innerhalb von Minuten nach der Geburt. Vor dem Beginn dieser Studie war nichts über das Vorhandensein von angiogenen Defekten in Jmjd6-/- Mäusen bekannt, allerdings ließen das anämische Erscheinungsbild, das verzögerte Wachstum und die kardialen Fehlbildungen auf eine Beeinflussung des Blutgefäßsystems dieser Mäuse schließen. Die Hif-Hydroxylase FIH1 ist bisher das einzige Mitglied der JmjC-Proteinfamilie für die eine Bedeutung in Angiogenese und Ischämie-vermittelter Neovaskularisation gezeigt wurde. Aufgrund dieser Vorbefunde, wurde in der vorliegenden Studie der Einfluss von Jmjd6 auf die Angiogenese sowohl in vitro in humanen Endothelzellen als auch in vivo in Jmjd6+/- Mäusen untersucht. Weiterhin wurde der von Jmjd6 in humanen Endothelzellen vermittelte molekulare Mechanismus unter Anwendung eines Affymetrix Exon Arrays untersucht um mRNAs zu identifizieren, die nach einer siRNA-vermittelten Suppression von Jmjd6 möglicherweise ein alternatives Spleißmuster aufweisen.... Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit enthaltenen Daten, dass Jmjd6 eine essentielle Rolle in der sauerstoffabhängigen Regulation von Angiogenese spielt. Mechanistisch reguliert Jmjd6 das Spleißen von sFlt1 und moduliert damit die extrazelluläre Konzentration dieses Angiogeneseinhibitors