Evolutionary history of philaenus spumarius (hemiptera, aphrophoridae) and the adaptive significance and genetic basis of its dorsal colour polymorphism

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Evolutiva), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Understanding the genetic basis of adaptive traits and how natural populations adapt to their environment, are fundamental problems in evolutionary biology. Colour polymorphisms are good systems in which these issues can be addressed. This work exploits the adaptive significance of the dorsal colour polymorphism in Philaenus spumarius and describes the efforts to identify genomic region(s) linked to the dorsal colour variation in this species. It also involves the investigation of the evolutionary pattern of P. spumarius. The phylogeographic results showed that main demographic and evolutionary events for the European populations seem to have occurred during Pleistocene, probably as a consequence of the main climatic oscillations that characterised this period. Evidence of recent gene-flow among Mediterranean peninsulas, as well as a close relationship between Iberia and North Africa, a probable British origin for the populations of the Azores and New Zealand, and indication that both western and north-eastern Europe colonised North America, were also found. Captivity experiments, testing the adaptive function of P. spumarius' dorsal colour polymorphism, indicated a higher longevity, a higher number of oviposition events, and a higher number of eggs laid for trilineatus than for marginellus and typicus. A total of 1,837 genomic markers (SNPs) and 928 loci were obtained through RAD sequencing for 33 individuals of three colour phenotypes (trilineatus, marginellus and typicus), and a genome wide association study performed to identify regions related to dorsal colour variation. Single and multi-association analyses identified a total of 60 SNPs associated with dorsal colour phenotypes but none of these SNPs showed homology with colour genes described in other insect species. A stronger differentiation of the trilineatus colour phenotype was also found with these markers. New genomic and transcriptomic resources were developed, constituting important tools and a basis for future research in this species. The resources correspond to a genome draft (25% of the total estimated genome (5.3 Gb)) and to an 81.4 Mb transcriptome assembly. The analysis of the candidate gene yellow found no association with dorsal colour phenotypes. Although suggesting that yellow is not involved in colour variation in P. spumarius, a possible effect of this gene can not be totally excluded without, further analyses. Phylogenetic analyses found contrasting patterns between yellow and the neutral ITS2, indicating that, contrary to ITS2, yellow is conserved within the genus. A higher haplotype and nucleotide diversity was observed for P. spumarius. This could be related to a higher sample size or to the different ecology of the species. The present thesis showed that P. spumarius constitutes a potential good model system to study adaptation and the evolutionary mechanisms involved in the maintenance of polymorphisms.Compreender a base genética de características adaptativas e o modo como as populações naturais evoluem e se adaptam ao seu ambiente é fundamental e constitui um dos temas mais interessantes para a Biologia Evolutiva. Os polimorfismos de coloração são bastante comuns em animais e plantas e, quando combinados com dados genéticos e ecológicos, podem ser excelentes sistemas para estudar não só o processo de adaptação mas também as alterações moleculares subjacentes à variação fenotípica. O presente trabalho teve como principais objetivos a exploração da importância adaptativa de um polimorfismo de coloração e a identificação de genes ou regiões genómicas potencialmente envolvidos na variação de cor. O organismo escolhido para este estudo foi a espécie Philaenus spumarius (L.) (Hemiptera, Aphrophoridae), vulgarmente conhecida como cigarrinha-da-espuma. Este inseto, que se encontra amplamente distribuído pela região Holártica, apresenta vários padrões de coloração da zona dorsal do corpo, com 16 fenótipos melânicos e não melânicos descritos, e cuja base genética e significado adaptativo permanecem por investigar. Para melhor compreender o processo de adaptação e, neste caso, para melhor estudar a base molecular que está por trás do polimorfismo dorsal de coloração de P. spumarius, é importante perceber a história evolutiva da espécie. Ao comparar-se o padrão de genes neutrais com o padrão de genes adaptativos, os efeitos da história evolutiva e/ou demografia são passíveis de ser distinguidos dos efeitos da seleção natural. Embora existam vários estudos genéticos sobre a biogeografia da espécie, estes focam-se, maioritariamente, em populações Europeias e carecem de estimativas de tempo para os principais eventos evolutivos e demográficos. Assim, uma primeira fase deste trabalho envolveu a investigação do padrão biogeográfico da cigarrinha-da-espuma, usando marcadores mitocondriais (Citocromo Oxidase I, Citocromo Oxidase II e Citocromo b) e nucleares (“Elongation Factor 1α”). Pela primeira vez obtiveram-se estimativas de tempo para os principais eventos demográficos e evolutivos ocorridos para esta espécie nas penínsulas Mediterrânicas e, analisaram-se os seus padrões de colonização fora da Eurasia, nomeadamente, no norte de África e na América do norte. Os resultados indicam que a divergência entre as populações de P. spumarius é recente, tendo ocorrido no Pleistoceno Médio/Superior, e está muito provavelmente ligada às alterações climáticas do período Quaternário. Os marcadores mitocondriais mostram que terá ocorrido uma primeira separação da cigarrinha-da-espuma em duas grandes linhagens: a linhagem “ocidental”, na região Mediterrânica, e a linhagem “oriental”, na zona da Anatolia/Cáucaso. Posteriormente, ter-se-á dado a diferenciação da linhagem “ocidental” em duas sub-linhagens: a linhagem “Mediterrâneo-ocidental” na Península Ibérica e a linhagem “Mediterrâneo-oriental” localizada na região dos Balcãs. Este padrão, no entanto, difere do padrão nuclear, o que sugere a existência de cruzamentos e/ou separação incompleta de linhagens. Os eventos de divergência que tiveram lugar nas várias penínsulas Mediterrânicas (refúgios a sul) terão, provavelmente, ocorrido durante os períodos glaciares do Pleistoceno. Após esses períodos, as populações de P. spumarius ter-se-ão expandido em direcção ao norte, a partir da Península Ibérica para o centro e oeste da Europa, e da Anatolia/Cáucaso (ou zonas mais a este) para o leste e centro da Europa. Este estudo também detetou a existência de fluxo genético entre as penínsulas Mediterrânicas e uma relação próxima entre as populações Ibéricas e do norte de África. As populações dos Açores e Nova Zelândia tiveram muito provavelmente uma origem a partir das populações Britânicas e a colonisação da América do norte parece ter sido feita por indivíduos pertencentes não só à linhagem ocidental mas também pertencentes à linhagem presente no norte da Europa. Para tentar perceber porque é que o polimorfismo de cor se mantém nas populações naturais de P. spumarius e qual a sua importância adaptativa, foram realizadas experiências em cativeiro nas quais se testaram diferenças na sobrevivência, sucesso reprodutor e duração de maturação dos ovos em três fenótipos de cor (typicus, trilineatus e marginellus). Curiosamente, foi observada uma maior longevidade para a forma trilineatus, assim como um maior número de eventos de oviposição e maior número total de ovos. O estudo sugere que, na manutenção deste polimorfismo poderão estar envolvidos vários factores e que as diferenças observadas entre o trilineatus e os restantes fenótipos são, possivelmente, uma maneira destes indíviduos compensarem uma maior taxa de ataque por parasitóides e/ou uma maior refletância da radiação solar, ambos reportados em estudos anteriores. No presente trabalho foi investigada a base genética deste polimorfismo. O objetivo consistiu em tentar identificar uma ou várias regiões genómicas associadas à variação do padrão de coloração dorsal em P. spumarius. Duas abordagens foram usadas. A primeira abordagem implicou um estudo de associação no qual se usaram marcadores (“Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)) distribuídos ao longo do genoma, obtidos através da técnica “Restriction Associated DNA (RAD) sequencing”. Com este método de sequenciação, um conjunto de 1837 marcadores foi obtido para 33 indivíduos e, associações com três padrões de cor (typicus, trilineatus e marginellus), foram testadas. As análises identificaram um total de 60 SNPs associados com o padrão de coloração dorsal e revelaram uma maior diferenciação dos indivíduos trilineatus. Os indivíduos deste morfotipo também se revelaram os mais diferenciados em várias características fisiológicas e de história de vida testadas nas experiências de cativeiro. Não foi encontrada homologia entre as regiões associadas e genes da cor já descritos para outras espécies. Os dados sugerem que loci de grande efeito, correspondendo a várias regiões do genoma, podem estar envolvidos na variação encontrada entre os três fenótipos investigados. Para além disso, indicam que uma arquitetura genética complexa pode estar a controlar quer a variação dos padrões de cor quer características da história de vida e que, a selecção natural pode não estar a atuar diretamente na cor. Para ajudar na caracterização das regiões genómicas associadas à variação dos padrões de coloração, o genoma parcial, correspondendo a 25% dos 5.3 Gb estimados, e o transcriptoma de P. spumarius (81.4 Mb) foram sequenciados e “assemblados”. Dos SNPs associados com a cor, 35% alinharam com o genoma e 10% com o transcriptoma indicando que, caso o transcriptoma esteja bem representado, a maioria dos SNPs associados está em regiões não codificantes. Uma abordagem de genes candidatos foi igualmente usada para investigar genes que estão envolvidos na coloração em outros insectos, e que podem potencialmente contribuir para o padrão de coloração em P. spumarius. Os padrões de cor em P. spumarius variam desde totalmente melânicos a totalmente pálidos. Em Drosophila, o gene yellow é um gene envolvido na síntese de melanina e, como tal, constitui um potencial candidato para a variação dos padrões de cor em P. spumarius e nas restantes espécies do género, também elas polimórficas para o padrão de coloração. Uma possível associação entre o yellow e os morfotipos typicus, trilineatus e marginellus foi testada mas nenhuma relação foi encontrada, sugerindo que este gene pode não estar diretamente envolvido na variação de cor nesta espécie. No entanto, como só uma parte do gene foi investigada, o seu envolvimento não pode ser totalmente excluído. A análise filogenética envolvendo o P. spumarius e algumas espécies próximas detetou a existência de padrões contrastantes entre este gene e o gene nuclear Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2). Isto indica que, contrariamente ao ITS2, que separa as espécies em dois grandes grupos, o gene yellow é conservado dentro do género. Para o yellow foi encontrado o mesmo haplotipo em quase todas as espécies de Philaenus excepto para o P. maghresignus e P. arslani. Uma maior diversidade genética foi observada para o P. spumarius, podendo ser resultado da diferente ecologia da espécie. Este estudo demonstrou que, apesar de a aplicação de uma abordagem de genes candidatos, numa espécie como o P. spumarius, ser difícil, é importante investigar outros genes que possam estar envolvidos na determinação deste polimorfismo. A presente tese mostrou que a cigarrinha-da-espuma, P. spumarius, é potencialmente um bom modelo para estudar o processo de adaptação e os mecanismos evolutivos envolvidos na manutenção dos polimorfismos nas populações naturais