Métodos de modificación génica dirigida en células humanas y su aplicación en el Síndrome de Wiskott-Aldrich

Tesis Doctoral presentada por María Alejandra Bernardi para optar al grado de Doctora por la Universidad de Valladolid; programa de doctorado en Investigación Biomédica impartido por el departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología.La modificación génica dirigida es un proceso mediante el cual, un gen defectuoso es sustituido por uno normal, lo que requiere la participación de la maquinaria celular de reparación mediante recombinación homóloga (RH). La RH es un mecanismo que en células de mamíferos ocurre a muy baja frecuencia, motivo por el cual nos hemos planteado estudiar diferentes condiciones experimentales que mejoren dicha frecuencia. Como método de estudio de frecuencia de RH, se generó una línea celular reportera HCT116-RCL, en la que se introdujo una copia del gen EGFP truncado en el extremo 3´ (no funcional). En paralelo, se generó un virus adenoasociado recombinante (rAAV), AAV-Δ5-EGFP-donor, que contenía el gen EGFP truncado en el extremo 5´. Mediante la utilización de esta línea celular y del rAAV y de una pareja de nucleasas TALEs, se estudió una proteína de fusión ScRad52 y una librería de 84 siRNAs dirigidos frente a genes implicados en la vía de recombinación no homóloga (NHEJ), así como frente a otros de funciones diferentes. También se llevaron a cabo tratamientos combinados de algunos siRNAs, para estudiar un posible efecto sinérgico en las mezclas. Se observó que, tanto ScRad52, como 12 de estos siRNAs, y algunas de las combinaciones fueron capaces de incrementar significativamente la frecuencia de RH en la célula reportera, sin alterar la viabilidad de manera significativa. Una vez determinadas las mejores condiciones para poder aumentar la frecuencia de RH, estas condiciones se aplicaron para la generación de una línea celular knock out para el gen WAS (Wiskott-Aldrich Syndrome) en fibroblastos primarios. Para ello se generó un rAAV que contenía la mutación en WAS que se quería introducir en el genoma celular. Estos fibroblastos KO, se asemejan a los fibroblastos de pacientes enfermos de Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS). WAS es una inmunodeficiencia primaria severa de herencia recesiva, ligada al cromosoma X, caracterizada por la presencia de infecciones recurrentes, eczema y trombocitopenia. Es así que, una vez obtenida la célula KO, se procedió a la corrección de la mutación en dichas células, esta vez, utilizando un rAAV que contenía una copia wild type del gen. En paralelo, se construyó una línea KO en la línea celular T Jurkat utilizando el sistema de nickasas CRISPR/Cas9. Finalmente, los fibroblastos primarios cuya mutación fue corregida, y que por lo tanto, contienen una copia normal del gen WAS se transdiferenciaron eficientemente a células progenitoras hematopoyéticas (CD45+), comprobándose la expresión normal de la proteína WASp. Hoy en día están llevándose a cabo diferentes protocolos de terapia génica en pacientes con diversas patologías. Dichos protocolos están basados en la adición del gen normal, que es deficiente en el paciente. Somos conscientes que, aunque la corrección génica dirigida sobre la que trata el presente trabajo de tesis doctoral, sería un método más seguro, quedan todavía muchos problemas que resolver para que esta nueva tecnología pueda ser aplicada en la práctica clínica. Es por ello, de mucho interés, seguir investigando nuevos métodos de inducción de RH y nuevos reactivos que puedan potenciar la modificación génica. Con la irrupción de sistemas sencillos y versátiles, como es el caso de las CRISPR/Cas9, y los continuos avances en la mejora de las frecuencias de RH conseguidas, se está avanzando a gran velocidad. Sin embargo, es importante generar aún más conocimiento sobre los mecanismos y sistemas de transferencia de los diversos reactivos a células o tejidos específicos que hagan suficientemente eficaz la expresión de los genes deseados en las células a tratar.El trabajo realizado en esta tesis ha sido financiado por: Consejería de Educación. Junta Castilla y León (VA244A11-2); Instituto de Salud Carlos III. Fondo de Investigación Sanitaria, FIS (PI10/02511); Fundación Ramón Areces (CIVP16A1843) y Beca Eurotango (Erasmus Mundus) de doctorado completo (34 meses).Peer Reviewe