Regulation of arginase II expression in macrophages by supernatants of apoptotic cells

Apoptotic cell (AC)-derived factors alter the physiology of macrophages (M Phi s) towards a regulatory phenotype that is characterized by enhanced production of anti-inflammatory mediators, an attenuated pro-inflammatory cytokine profile and reduced nitric oxide (NO) formation. Impaired NO production in response to ACs or AC-conditioned medium (CM) is facilitated by arginase II (ARG II) expression, which competes with inducible NO synthase for L-arginine. In this study, I investigated the signaling pathway that allowed CM to upregulate ARG II in M Phi s. A sphingolipid, further identified as sphingosine-1-phosphate (S1P), was required but authentic S1P alone only produced small effects. S1P acted synergistically with a so far unidentified factor to elicit high ARG II expression. S1P signaled through S1P receptor 2 (S1P2), since the S1P2-antagonist JTE013 and siRNA knock-down of S1P2 prevented ARG II upregulation. Further, inhibition and knock-down of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) attenuated CM-mediated ARG II protein induction. Exploring ERK5-dependent transcriptional regulation, promoter deletion and luciferase reporter analysis of the murine ARG II promoter (mpARG II) suggested the involvement of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responsive element binding protein (CREB). This was confirmed by EMSA analysis and decoyoligonucleotides scavenging CREB, thereby preventing it from activating target genes and thus, blocking ARG II expression. I concluded that AC-derived S1P binds to S1P2 and acts synergistically with other factors to activate ERK5 and concomitantly CREB. This signaling cascade shapes an anti-inflammatory M Phi phenotype by ARG II induction. Further investigations of ERK5-dependent CREB activation suggested an indirect mechanism implying that ERK5 inhibited phosphodiesterase 4 (PDE4) and thus, prevented hydrolysis of cAMP. Since S1P-dependent ERK5 activation presumably inhibited PDE4, subsequent cAMP accumulation led to enhanced PKA activity and CREB-mediated transcription. The unidentified factor(s) besides S1P probably provoked the required elevation of cAMP production in M Phi s. Indeed, pharmacological inhibition of cAMP-producing adenylyl cyclase with SQ22536 as well as cAMP-dependent protein kinase A (PKA) with KT5720 suggested cAMP to be involved in CM-mediated ARG II up-regulation. Furthermore, forskolin-dependent activation of adenyly cyclase and simultaneous rolipram-mediated inhibition of PDE4 mimicked CM-induced ARG II expression. Considering these findings, I propose that one or several unidentified factors in CM provoke cAMP production in M Phi s. In parallel, AC-derived S1P activates ERK5, which inhibits PDE4-dependent cAMP hydrolysis, further raising intracellular cAMP levels. Thus, unrestricted continuous cAMP signaling via PKA/CREB, results in a time-dependent and sustained ARG II induction.Apoptotische Zellen (ACs) setzen Faktoren frei, die die biologischen Reaktionen von Makrophagen (M Phi s) beeinflussen, indem sie einen regulatorischen M Phi-Phänotyp induzieren. Dieser ist sowohl durch eine erhöhte anti- als auch eine verminderte pro-inflammatorische Botenstoffproduktion, sowie durch eine reduzierte Stickstoffmonoxid(NO)-Synthese gekennzeichnet. Die Reduktion der NO-Produktion durch ACs oder AC-konditioniertes Medium (CM), erfolgt durch Induktion der Arginase II (ARG II), die mit der NO-Synthase um das Substrat L-Arginin konkurriert. In der vorliegenden Arbeit untersuchte ich die CM-induzierten, zellulären Signalwege, die zur ARG II Expression in M Phi s führen. Das im CM vorhandene Sphingolipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) war erforderlich für die ARG II Induktion. Da authentisches S1P alleine nur geringe Effekte zeigte, wirkte es höchstwahrscheinlich synergistisch mit einem oder mehreren, bis jetzt unidentifizierten, Faktoren um eine starke ARG II Expression auszulösen. Dabei aktivierte S1P den S1P Rezeptor 2 (S1P2), da der S1P2-Antagonist JTE013 und die Inhibition der Genexpression durch siRNA die ARG II Induktion verhinderten. Weiter konnte die CM-bedingte ARG II Proteininduktion durch Hemmung und siRNA Knockdown der ‚extracellular signal-regulated kinase 5’ (ERK5) reduziert werden. Die Untersuchung der ERK5-vermittelten Transkriptionsregulation durch Luziferase-Reporteranalysen unter Verwendung von Deletions-Konstrukten des murinen ARG II Promotors (mpARG II) deutete auf die Beteiligung des ‚cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responsive element binding protein’ (CREB) an der ARG II Regulation hin. Dies wurde durch EMSA-Analysen und den Einsatz von Oligonukleotiden, die spezifisch CREB binden, bestätigt. Hier kann das an Oligonukleotide gebundene CREB seine Zielgene nicht aktivieren und dementsprechend auch nicht die Transkription der ARG II induzieren. Daraus schließe ich, dass S1P in CM zur ARG II Induktion in M Phi s beiträgt, indem es an S1P2 bindet und synergistisch mit anderen Faktoren zur Aktivierung von ERK5 und anschließend von CREB führt. Diese Signalkaskade induziert einen anti-inflammatorischen M Phi-Phänotyp, indem sie ARG II hochreguliert. Die weitere Untersuchung der ERK5-vermittelten CREB Aktivierung ließ einen indirekten Mechanismus vermuten, bei dem ERK5 die Phosphodiesterase 4 (PDE4) hemmt und damit den Abbau von cAMP verhindert. Da die S1P-abhängige ERK5 Aktivierung PDE4 vermutlich inhibiert, steht der PKA mehr cAMP zur Verfügung, um CREB zu aktivieren. Der/die unidentifizierte(n) Faktor(en) neben S1P bewirkte(n) wahrscheinlich die benötigte cAMP-Synthese in M Phi s. In der Tat verringerte die pharmakologische Hemmung der cAMP-produzierenden Adenylatzyklase mit SQ22536, sowie der cAMP-aktivierten Proteinkinase A (PKA) mit KT5720, die CM-vermittelte ARG II Induktion. Außerdem imitierten die Aktivierung der Adenylatzyklase durch Forskolin und die gleichzeitige Hemmung der PDE4 durch Rolipram die CM-bedingte ARG II Induktion. Angesichts dieser Befunde schlage ich vor, dass ein oder mehrere unidentifizierte Faktoren im CM zur cAMP-Produktion in M Phi s führen. Parallel dazu aktiviert S1P aus ACs ERK5, wodurch PDE4 inhibiert und damit die cAMP-Hydrolyse gehemmt wird. Auf diese Weise bewirkt das anhaltende cAMP-Signal die PKA-vermittelte CREB Aktivierung, die die zeitabhängige und nachhaltige ARG II Expression verursacht