Regulation of neutral ceramidase in glomerular messangial cells

During the past several years, ceramide has emerged as an important second messenger triggering cell responses including proliferation, differentiation, growth arrest and apoptosis. This thesis has focused on the regulation of neutral ceramidase which critically determines, in concert with ceramide generating sphingomyelinases, the intracellular ceramide levels. In the first part it is reported that besides a rapid and transient increase in neutral sphingomyelinase activity a second delayed peak of activation occurs after hours of IL-1beta treatment. This second phase of activation is first detectable after 2 h of treatment, and steadily increases over the next two hours reaching maximal values after 4 h. In parallel, a pronounced increase in neutral ceramidase activity is observed, which accounts for a constant or even decreased level of ceramide after long-term IL-1beta treatment, despite continuous sphingomyelinase activation. The increase in neutral ceramidase activity is due to expressional up-regulation, as detected by an increase in mRNA level and enhanced de novo protein synthesis. The increase of neutral ceramidase protein levels and activity can be blocked dosedependently by the p38- mitogen-activated protein kinase (p38-MAPK) inhibitor, SB 202190, whereas the classical MAPK pathway inhibitor U0126, and the PKC inhibitor Ro 31-8220 were ineffective. Moreover, co-treatment of cells for 24 h with IL-1~ and SB 202190 leads to an increase in ceramide formation. Interestingly, IL-1beta-stimulated neutral ceramidase activation is not reduced in mesangial cells isolated from mice deficient in MAPK-activated protein kinase 2 (MAPKAPK-2), which is one possible downstream substrate of the p38-MAPK, thus suggesting that the p38-MAPK-mediated induction of neutral ceramidase occurs independently of MAPKAPK-2. The results suggest a biphasic regulation of sphingomyelin hydrolysis in cytokine-treated mesangial cells with a delayed de novo synthesis of neutral ceramidase counteracting sphingomyelinase activity and apoptosis. Neutral ceramidase may thus represent a novel cytoprotective enzyme for mesangial cells exposed to inflammatory stress conditions. In a second part, the effect of NO on neutral ceramidase was studied. Ceramide levels are strongly increased in a delayed fashion by stimulation of renal mesangial cells with NO. This effect is due to a dual action of NO, comprising an activation of sphingomyelinases and an inhibition of ceramidase activity. The inhibition of neutral ceramidase activity correlates with the decrease of neutral ceramidase protein. A complete loss of neutral ceramidase protein is obtained after 24h of NO stimUlation. Moreover, the NO-induced degradation is reversed by the protein kinase C (PKC) activator, 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) , but also by the physiological PKC activators platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), angiotensin II and ATP, resulting in a normalisation of neutral ceramidase protein as well as activity. In vivo phosphorylation studies using 32Pj-labelled mesangial cells, reveal that TPA, PDGF-BB, angiotensin II and ATP trigger an increased phosphorylation of the neutral ceramidase, which is blocked by the broad-spectrum PKC inhibitor Ro-31 8220, but not by CGP 41251, which has a preferential action on Ca2+-dependent PKC isoforms, thus suggesting the involvement of a Ca2+-independent PKC isoenzyme. In vitro phosphorylation assays using recombinant PKC isoenzymes and neutral ceramidase immunoprecipitated from unstimulated mesangial cells, show that particularly the PKC-alpha isoform, and to a lesser extent the PKC-a isoform, are efficient in directly phosphorylating neutral ceramidase. The data show that NO is able to induce degradation of neutral ceramidase thereby promoting accumulation of ceramide in the cell. This effect is reversed by PKC activation, most probably by the PKC-delta isoenzyme, which may directly phosphorylate and thereby, prevent neutral ceramidase degradation. In the third chapter it is demonstrated that the NO-triggered degradation of neutral ceramidase involves activation of the ubiquitin/proteasome complex. The specific proteasome inhibitor, lactacystin, completely reverses the NO-induced degradation of ceramidase protein and neutral ceramidase activity. As a consequence, the cellular amount of ceramide, which drastically increases by NO stimulation, is reduced in the presence of lactacystin. Furthermore, ubiquitinated neutral ceramidase accumulates after NO stimulation. The data clearly show that the ubiquitin/proteasome complex is an important determinant of neutral ceramidase activity and thereby regulates the availability of ceramide. In a last part, the cellular localisation of neutral ceramidase was investigated using green fluorescent protein (GFP) as fusion protein to examine cellular distribution and translocation of neutral ceramidase. Unstimulated HEK 293 cells reveal after transient transfection experiments that neutral ceramidase is preferentially localized in the cytoplasm. PKC activation led to an accumulation of neutral ceramidase at the nuclear membrane. In summary, this work demonstrates that the neutral ceramidase is a fine regulated protein that plays a critical role in regulating intracellular ceramide levels and thereby the cell's fate to undergo apoptosis or survive. Regulation of neutral ceramidase can be achieved on all levels, i.e. on the mRNA level, the protein level or posttranslationally by phosphorylation and subcellular translocation. Future work will reveal whether neutral ceramidase can serve as a therapeutic target in the development of novel antiinflammatory and anti-tumour drugs.Dem deutschen Arzt Tudichum gelang, in der zweiten Halfte des 19. Jahrhunderts bei fraktionierenden Kristallisationen von alkoholischen Hirnextrakten Verbindungen zu isolieren, die neben Zucker und Fettsauren eine organische Base enthielten. Da diese Base ihm rätselhaft erschien, gab er dieser Substanz in Anlehnung an die griechische Sage Von der Sphinx den Namen Sphingosin. Nach dieser Entdeckung haben Sphingolipide einen groBen Aufschwung erlebt, da sich herausstellte, dass Sphingolipide neben ihren Funktionen als Membranbausteine wichtige Eigenschaften als Signalmoleküle innerhalb der Zelle offenbaren. Ausgangspunkt für diese Entwicklung war die Beobachtung, dass die Proteinkinase C (PKC), ein Signalmolekül, welches durch den Lipid-Botenstoff Diacylglycerin (DAG) aktiviert wird, durch Sphingosin gehemmt wird. Ceramid, eine zentrale Verbindung innerhalb der Klasse der Sphingolipide, wird durch verschiedene Sphingomyelinasen freigesetzt und zuätzlich auch im Zuge einer de novo Synthese von Sphingolipiden, bzw. beim Iysosomalen Abbau glykosilierter Sphingolipide produziert. Da Sphingomyelin jedoch in großen Mengen in der Plasmamembran vorkommt, und nur ein Schritt zur Bildung von Ceramid nötig ist, geht man davon aus, dass vor allem die Sphingomyelinasen für eine schnelle Ceramid-Freisetzung im Rahmen von Signaltransduktions-Prozessen von Bedeutung sind. Die Signalmoleküle Sphingosin und Sphingosin-1-Phosphat (S1 P) werden aus Ceramid durch Ceramidasen gebildet und scheinen im Gegensatz zu Ceramid, das vorwiegend zum Stop des Zell-Zyklus und zur Apoptose führt, vor allem an den Prozessen der Zell-Aktivierung wie Mitogenese und Proliferation beteiligt zu sein. Ceramid als zentrales Signalmolekül wurde umfangreich charakterisiert. Nach Stimulation von Zellen mit entzundlichen Zytokinen wie Interleukin 1beta (IL-1beta), Tumornekrosefaktor alpha (TN Falpha) und Interferon delta, oder Stressfaktoren wie UV-Strahlung, Röntgenstrahlung, Hitzeschock oder oxidativem Stress kommt es zur Aktivierung von sauren und neutralen Sphingomyelinasen, die Sphingomyelin in Zellmembranen zu Ceramid spalten. Die Regulation von Sphingomyelinasen liefern aber nur einen Teilaspekt, die Bildung von Ceramid, für das molekulare Verständnis des Ceramid Stoffwechsels in der Zelle. Einen eben so wichtigen Beitrag liefern die den Abbau regulierenden Enzyme, die Ceramidasen. Ceramidasen sind Enzyme, welche in der Lage sind, Ceramide in Sphingosin und freie Fettsäure zu spalten. Sphingosin kann dann in der Foige zu Sphingosin-1-phosphat phosphoryliert werden. Sphingosin-1-phosphat ist als ein Mitogen und damit Förderer von Wachstum in verschiedenen Zelltypen beschrieben. Sphingosin entsteht nicht über de novo Synthese, so dass die Ceramidase-Aktivität nicht nur für den Abbau von Ceramid wichtig ist, sondern auch für das Entstehen relevanter Sphingosin- und Sphingosin-1-phosphat-Spiegel verantwortlich ist. Entsprechend der assoziierten Zellantworten auf Ceramide bzw. Sphingosin-1-phosphat stellen die Ceramidasen Schlüsselenzyme in der zellulären Regulation der Balance zwischen programmiertem Zelltod und Oberleben dar. Ceramidasen werden abhängig von ihrem pH-Optimum in drei Klassen unterteilt: man unterscheidet saure, neutrale und alkalische Ceramidasen. Diese Einteilung basiert jedoch nicht ausschließlich auf dem entsprechenden pH-Optimum, sondern gründet sich zusätzlich auf Unterschiede in der genetischen Information. Bis heute ist über die Regulation und die Beteiligung der Ceramidasen an der zellulären Signalübertragung nur sehr wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit ist es, diese Rolle der Ceramidasen und im Besonderen der neutralen Ceramidase in der zellulären Signalübertragung zu erforschen, vornehmlich die Rolle bei zellulärem Stress und Entzündungen. Weiterhin gilt es, die Effekte auf die Elimination von Ceramid und die Produktion von Spingosin-1-phosphat zu erforschen, um damit die Konsequenzen für das Gleichgewicht zwischen programmiertem Zelltod auf der einen Seite und Wachstum und Überleben auf der anderen Seite aufzudecken. ..