Studien zur Dynamik der Integrinrezeptoren nach Tumor-Endothelzell-Kontakt am Beispiel des Nierenzellkarzinoms

Das klarzellige Nierenzellkarzinom (RCC) ist bei eier Inzidenz von 9 / 100 000 vor allem gekennzeichnet durch seine hohe Mortalität. Die Ursache dafür ist multifaktoriell, eine späte Diagnose, lokal fortgeschrittenes Wachstum, Fernmetastasierung und das Fehlen einer suffizienten Chemo-, bzw. Immunotherapie spielen eine entscheidende Rolle. Der Mangel an therapeutischen Optionen erfordert weitergehende Forschungsmaßnahmen zur Aufklärung der Tumormetastasierungsstrategien und zur Entwicklung antitumoraler Therapien. Migration und Extravasation werden als essentielle Parameter des Metastasierungsprozesses beschrieben. In einem modellhaft geschaffenen Metastasierungsszenario wurde das dynamische Verhalten von Integrinrezeptoren bei der Adhäsion von Tumorzellen am Gefäßendothel oder der Matrix beobachtet. Zu diesem Zweck wurden mehrere Nierentumorzelllinien, teilweise auch unter Blockade- oder Stimulationsbedingungen, diesem Interaktionsprozess ausgesetzt. Die Zellen wurden in biologischen Assays, fluorometrisch, mittels konfokaler Laserscanmikroskopie und mikrobiologisch auf der RNA-, der Protein- und der zellulären Ebene bezüglich Veränderungen von Protoonkogenen, Tumorsuppressoren und Adhäsionsmolekülen untersucht. Der Nachweis auf RNA-Ebene erfolgte mittels PCR, auf der Protein-Ebene mit Hilfe von Western-Hybridisierung und Durchflusszytometrie. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit funktionelle Adhäsionsstudien und Verdrängungsassays auf Endothelzellen und Matrixproteinen durchgeführt, um mögliche Unterschiede der Malignität in Bezug auf das Migrationsverhalten der Nierentumorzellen aufzuzeigen. Dabei konnte erstmalig eine transiente Integrinrezeptorreduktion auf Nierentumorzellen nach Kontakt zum Endothel mit einer sich anschließenden Re-Expression nachgewiesen werden. Für einen umschriebenen Zeitraum wird die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsion der Tumorzellen reduziert. Dieser Adhäsionsverlust ist verbunden mit einem schnellen und reversiblen Verlust der Integrin-Subtypen α2β1, α3β1 und α5β1. Begleitend wurde eine reduzierte Expression intrazellulärer Signalkaskadenproteine wie PKCδ, PKCε, PKCγ, MEK1, ERK1, p38, p38 phosph., JNKphosph., JNK und RACK1 beobachtet. Zusammen scheinen diese Prozesse in eine dynamische Tumorzell-Migrationsstrategie involviert zu sein. Mutmaßlich spielen die dynamischen und reversiblen Veränderungen des Integrin Rezeptorprofils eine wichtige Rolle im Bereich der Tumorzellinvasion, indem die Zellen von einem adhäsiven Zustand weg, hin zu einem motilen und invasiven Status transformiert werden. Eine einzelne Zelle kann sich so im Sinne einer Metastase aus dem initialen Tumoraggregat loslösen, ein gleiches Phänomen für die Migration der Tumorzellen aus dem Gefäßsystem in das Zielgewebe wird vermutet. Allerdings muss besonders herausgestellt werden, dass die Dynamik der transendothelialen Invasion auch integrin-unabhängige Phasen beinhaltet, die ganz offensichtlich für eine zielgerichtete Motilität verantwortlich ist. Während dieser Interaktion von Tumorzellen mit Zellen des Gefäßsystems konnten außerdem morphologische Veränderungen der Tumorzellen im Sinne eines Entdifferenzierungsprozesses beobachtet werden. Der Auslöser dieses Effektes ist durch weitere Forschungsaktivitäten zu klären. Aufgrund der multifunktionalen Wirkungsweise der Integrinrezeptoren erscheint als therapeutisches Ziel die Wiederherstellung der ursprünglichen, physiologischen Integrinbalance anzustreben. Weniger die Expressionsdichte eines einzelnen Integrintyps, als vielmehr die Balance, respektive Dysbalance mehrerer Integrin-Untereinheiten reguliert Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen und trägt dadurch zur Prävention der Disseminierung des lokal fortgeschrittenen bzw. metastastasierten Nierenzellkarzinomes bei.The clear cell renal cell carcinoma (RCC) is characterized by a high mortality with a mean incidence rate of 9 / 100 000. Several factors account for the poor patient prognosis. 30% of patients present metastatic disease at primary diagnosis and approximately 40% experience tumor recurrence after surgical treatment for localized disease. Treatment options for metastatic RCC have been limited due to its resistance to chemotherapy and radiotherapy. Immunotherapy with interleukin-2 or interferon-alpha provides benefit only in a small subset of patients and is associated with severe side effects. An increased understanding of the molecular pathophysiology underlying RCC is necessary to develop novel and high efficient treatment options. Since invasion and metastasis are the critical events of malignant tumor progression and the main cause of treatment failure, the present research was focused on the RCC-endothelium and RCC-extracellular matrix interaction and the dynamics of integrin adhesion receptor expression. A tumor-endothelium co-culture assay was established and β1-integrin alterations explored on several RCC cell lines before and after endothelial cell contact. Adhesion properties of RCC cell lines were explored as well as integrin expression and intracellular signalling using flow cytometry, confocal microscopy, western blotting and RT-PCR. Evidence is presented that the interaction of RCC cells with human vascular endothelial cells is coupled with a rapid and reversible loss of β1-integrin subtypes, notably, α2β1, α3β1 und α5β1 integrins. Furthermore, it is demonstrated that this process is accompanied by a reduced PKCδ, PKCε, PKCγ, MEK1, ERK1, p38, p38 phosph., JNKphosph., JNK und RACK1 activity and diminished binding of tumor cells to matrix proteins. Further intracellular signalling components are altered in RCC cells after contacting HUVEC membrane fragments, which altogether may represent the dynamics of the tumor cell migration strategy. Presumably, the dynamic and reversible alterations of the integrin profile play an important part in tumor cell invasion, switching the cells from being adhesive to becoming motile and invasive. In fact, the loss of integrins may facilitate detachment of RCC cells from the vasculature and promote dynamic movement and spread into the target organ. Certainly it has to be placed particular emphasis on the dynamic of the transendothelial invasion, which includes additional integrin independent phases and is obviously responsible for a targeted motility. During this interaction between tumour cells and the vascular cells also morphologic changes with the mind of the de-differentiation process can be newly discovered. The cause therefore has to be found in further scientific work. From a therapeutical viewpoint, innovative treatment strategies should concentrate on re-establishing the original physiologic integrin balance to alter cell-cell and cell-matrix interaction and to prevent RCC dissemination