Investigations on the regulation of 5-lipoxygenase gene expression by calcitriol and transforming growth factor beta

5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.Die 5-Lipoxygenase (5-LO) fungiert als Schlüsselenzym bei der Bildung von proinflammatorischen Leukotrienen. In einer Zweischrittreaktion katalysiert sie zunächst die Umwandlung von Arachidonsäure zu dem Intermediat 5-HpETE (5(S)-Hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraesäure) durch Einführung von molekularem Sauerstoff. Danach schließt sich eine Dehydrierung an, in der das instabile Epoxid Leukotrien A4 (LTA4) gebildet wird. Die 5-LO wird vorwiegend in Zellen myeloischen Ursprungs wie Mastzellen, Makrophagen, Monozyten, B-Lymphozyten und Granulozyten exprimiert. Diese zelltypische Expression lässt sich vermutlich auf den DNA-Methylierungsstatus des 5-LOPromotors zurückführen. In den 5-LO-negativen Zelllinien HL-60 TB und U937 liegt der 5-LO-Promotor stark methyliert vor. Erst durch ein Demethylierungsagenz und anschließender Differenzierung kann die 5-LO von ihnen exprimiert werden. Auch Trichostatin A (TSA), ein Histondeacetylaseinhibitor, hat Einfluss auf die 5-LO Expression. Behandlung mit TSA hat eine erhöhte 5-LO-Promotoraktivität zur Folge. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass TSA auch demethylierende Eigenschaften besitzt. Außer durch DNA-Methylierung und Histondeacetylierung kann die 5-LO-Genexpression durch die differenzierungs-induzierenden Agenzien 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (Calcitriol) und den transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGFβ) reguliert werden. Differenzierung der myeloischen Krebszelllinien HL-60 und MM6 mit Calcitriol und TGFβ führt zur Erhöhung der Menge an 5-LO-Primärtranskripten, einem starken Anstieg der Bildung der reifen 5-LO-mRNA, der 5-LO-Proteinexpression und der 5-LO-Aktivität. Dieser Anstieg ist bei der Zelllinie MM6 deutlicher ausgeprägt. Durch die Behandlung mit den beiden Agenzien wurde die 5-LO-mRNA Bildung 64x, die Proteinexpression 128x und die 5-LO Aktivität über 500x gesteigert. Bereits die alleinige Behandlung mit Calcitriol führt zu einer erhöhten 5-LO-Genexpression. Durch gemeinsame Behandlung mit TGFβ wird diese Wirkung jedoch um ein Vielfaches potenziert. Die Induktion von 5-LO-mRNA durch Calcitriol und TGFβ ist zum Teil abhängig von Protein-de-novo-Synthese, da die TGFβ-Wirkung, nicht jedoch die Calcitriol-Wirkung, durch den Proteinsyntheseinhibitor Cycloheximid unterdrückt werden konnte. Dies deutete daraufhin, dass die 5-LO ein primäres Calcitriol Responsegen ist. Durch exonspezifische RT-PCR-Analysen wurde gezeigt, dass Calcitriol und TGFβ die 5- LO-mRNA Reifung und 5-LO-Transkriptelongation fördern. Diese posttranskriptionellen Effekte sind allerdings von Protein-de-novo-Synthese abhängig. Bisherige Daten schlossen einen alleinigen Effekt von TGFβ und Calcitriol auf den 5-LOPromotor aus. So zeigten Reportergen-Konstrukte, welche allein den 5-LO-Promotor enthielten, keine Induzierbarkeit durch Calcitriol / TGFβ, während solche Konstrukte, die außerdem die kodierende Sequenz (pN10cds) beziehungsweise die kodierende Sequenz und die letzten vier Introns des 5-LO-Gens (pN10cdsInJM) enthielten, eine Induzierbarkeit aufwiesen. Die mit diesen Konstrukten erhaltenen Induktionen waren von der Kotransfektion der nukleären Rezeptoren VDR (Vitamin D Rezeptor) und RXR (Retinoid X Rezeptor) abhängig. Darüberhinaus gaben RT-PCR-Untersuchungen Hinweis auf einen Einfluss von Calcitriol und TGFβ auf die mRNA-Prozessierung der 5-LO beziehungsweise, dass erst durch Behandlung mit beiden Agenzien eine korrekte 5-LOProzessierung ermöglicht wird. Basierend auf den Ergebnissen dieser früheren Untersuchungen wurde in meiner Arbeit der Fokus auf Sequenzen außerhalb der 5-LOPromotorregion und ihren Einfluss auf die Expression der 5-LO gelegt. Ausgehend von einem Konstrukt, welches sowohl den 5-LO-Promotor als auch die kodierende Sequenz enthielt (pN10cds), klonierte ich Reportergen-Konstrukte, durch die das Leseraster der kodierenden Sequenz verschoben wird. Diese zeigten im Reportergenassay allerdings eine ähnliche Induzierbarkeit durch Calcitriol und TGFβ wie das Ausgangskonstrukt. Eine mögliche Leserasterverschiebung beziehungsweise eine Revertierung derselben durch die beiden Agenzien konnten wir somit ausschließen. Darüberhinaus hatte weder die Deletion oder Mutationen von Sp1-Bindungsstellen (GC Boxen) noch die zweier Vitamin-Response-Elemente (VDRE) im 5-LO-Promotor einen merklichen Einfluss auf den Effekt von Calcitriol und TGFβ. Mögliche Enhancersequenzen in der kodierenden Sequenz oder in den Introns des 5-LO-Gens scheinen mit den untersuchten Sequenzen gar nicht oder nur schwach zu interagieren. Von mir klonierte Konstrukte gaben Hinweis auf eine völlige Unabhängigkeit des durch Calcitriol und TGFβ vermittelten Effektes vom 5-LO-Promotor im Reportergenassay. Dies wurde durch den Austausch des 5-LO-Promotors durch einen SV40-Promotor (zu SV40cds) und Umklonierung der kodierenden Sequenz der 5-LO in einen promotorlosen Vektor (pGL3cds) bestätigt. Beide Konstrukte zeigten eine vergleichbare Induzierbarkeit durch die beiden Agenzien wie das Konstrukt, welches den 5-LO-Promotor (pN10cds) enthielt. Austausch der cds der 5-LO durch die cds der LTA4 Hydrolase hingegen, einer kodierenden Sequenz gleicher Länge, führte zum totalen Verlust der Aktivitätssteigerung durch Calcitriol / TGFβ. Damit konnte ich beweisen, dass unter den in vitro Bedingungen des Reportergenassays der Calcitriol / TGFβ vermittelte Effekt völlig promotorunabhängig ist, sondern vielmehr spezifisch für die kodierende Sequenz (cds) der 5-LO ist. Letztendlich konnte durch meine Untersuchungen gezeigt werden, dass die kodierende Sequenz der 5-LO unter dem Einfluss von VDR / RXR selbst eine Promotorfunktion im Reportergenassay besitzt. Weitere Klonierungen wurden ohne Einschluss des 5-LO-Promotors vorgenommen. Durch Untersuchungen mit 5Deletionskonstrukten ausgehend von einem Konstrukt, das die Exons 10 bis 14 einschließlich der letzten 4 Introns enthält, konnte ich das Exon 12 (mit Intron L) als stark positiv regulierende Region identifizieren. Deletionen von Exon 12 und Intron L führten zu einer reduzierten Induzierbarkeit durch Calcitriol von 7,8-fach auf 4,8- fach und Deletionen von Intron M verringerten die Induzierbarkeit durch Calcitriol signifikant von 9-fach auf 2,5-fach. Somit konnte ich putative VDREs in Exon 12 und Intron M des 5-LO-Gens eingrenzen. Sequenzanalysen zeigten ein mögliches VDRE in Exon 12 (+69599 vom Transkriptionsstart (TSS)) und mehre VDREs in Intron M auf. Schrittweise Deletionen von Intron M wiesen auf ein funktionelles VDRE (+70103) hin. Die Mutation dieser Response-Elemente ergab einen Rückgang der Induzierbarkeit durch Calcitriol, welcher vor allem bei der Mutation des VDRE in Intron M stark ausgeprägt war. Dort konnte die aktivitätssteigernde Wirkung der Calcitriol-Behandlung um 40% gesenkt werden. Darüberhinaus konnte ich ein weiteres putatives VDRE in Exon 10 (+68924) mit angrenzender SMAD Bindungsstelle (SBE) (+68943) ermitteln. SMAD Proteine sind Effektoren des TGFβ Signalweges. Neben der Identifikation dieser drei VDRE mittels Reportergenassay konnte ich außerdem eine Bindung des VDR / RXR-Heterodimers an diese Sequenzen per Gelshift in vitro zeigen und diese Bindung in vivo mittels Chromatinimmunopräzipitation (ChIP)-Assay in MM6 Zellen verifizieren, wobei die Bindung selbst auch ohne Ligandbehandlung festzustellen war. Da der VDR auch ohne Ligand an VDRE binden kann, dann aber transkriptionsreprimierende Wirkung aufgrund von Korepressor-Rekrutierung hat, könnte eine mögliche Erklärung für die Detektion ohne Behandlung sein. Der Histon H4 Acetylierungsgrad konnte durch 8- und 24-stündige Calcitriol- und Calcitriol / TGFβ-Behandlung noch erhöht werden. Die Steigerung des Acetylierungsgrads spricht dafür, dass zu diesem Zeitpunkt die Korepressoren, die mit VDR assoziiert vorliegen, durch Koaktivatoren ausgetauscht werden. Auch wurde nach 8- und 24-stündiger Inkubation mit der Kombination Calcitriol / TGFβ eine erhöhte VDR-Expression an den untersuchten Stellen detektiert. Außerdem konnte in der Region VDRE 10 in vivo eine erhöhte Rekrutierung von SMAD3 nach 8- und 24-stündiger Calcitriol / TGFβ-Behandlung gezeigt werden. Da diese Region auch ein benachbartes SBE enthält, lässt das Ergebnis eine Interaktion zwischen dem VDR und SMAD3 vermuten. Frühere RT-PCR Untersuchungen haben gezeigt, dass die kombinierte Behandlung mit Calcitriol und TGFβ einen starken Einfluss auf die posttranskriptionelle Regulation der 5-LO hat. Daher wurden im ChIP-Assay auf verschiedene Elongationsmarker in Exon 10, Exon 12 und Intron M und den Einfluss, den eine Calcitriol / TGFβ Behandlung hat, getestet. H3K36 Tri- und H4K20 Monomethylierungen, die als Elongationsmarker dienen, konnten in allen untersuchten Regionen des 5-LO- Gens in MM6 Zellen detektiert werden. Durch 24-stündige Calcitriol und Calcitriol / TGFβ Behandlung wurde der H3K36 Trimethylierungs-Status in der Region des VDRE 10 noch gesteigert. Der H4K20 Monomethylierungs-Status konnte durch 24-stündige Calcitriol / TGFβ-Behandlung in allen untersuchten Regionen deutlich erhöht werden. Die Rekrutierung der Elongationsform der RNA Polymerase II, die eine typische Phosphorylierung an Serin 2 der carboxyterminalen Domäne aufweist, wurde durch 24-stündige Calcitriol / TGFβ Behandlung in allen untersuchten Regionen verstärkt. Die Ergebnisse der untersuchten Elongationsmarker weisen daraufhin, dass VDR-abhängig von Calcitriol / TGFβ Behandlung- durch die neu identifizierten VDRE die 5-LO-Expression durch verstärkte Transkriptelongation fördert. Auch fördern die beiden Agenzien vermutlich die Rekrutierung von polyadenylierenden Faktoren über Phosphorylierung von Serin 2 der RNA Polymerase II und dadurch die 5- LO- mRNA Reifung