Affinitätsmarkierung von Anionenkanälen und regulatorischen Proteinen im sarcoplasmatischen Reticulum

Die Vesikel des sarcoplasmatischen Reticulums (SR) der Skelettmuskulatur von Kaninchen enthalten neben Kanälen hoher (big chloride channel') und geringer (small chloride channel') Leitfähigkeit auch der äußeren Mitochondrienmembran bekannten voltage­dependent anion­selective channel' (VDAC). Der Kanal konnte mittels Immunodetektion Vesikeln heavy' und light' nachgewiesen, durch Affinitätschromatographie aufgereinigt nach der Spaltung Bromcyan teilsequenziert werden. Die Partialsequenzen beiden erhaltenen Fragmente stimmen Isoform 1 VDAC dem Cornea­Endothel Oryctolagus cuniculus (Kaninchen) sowie aus dem Mitochondrium überein. Jedoch weist Kanal unterschiedliche Eigenschaften auf. zeigt Gegensatz dem mitochondrialen VDAC keine Affinität dem Anionenkanal­Inhibitor SITS bildet SR­Membran keine Komplexe anderen Proteinen Bekannte Effektoren mitochondrialen VDAC wie NADH, DCCD anti­VDAC Antikörper zeigen Sulfat­Efflux­Experimenten entweder keine oder eine gegensätzliche Wirkung, was einen weiteren Hinweis unterschiedliche Regulationsfaktoren gibt. Die fehlenden Transporteigenschaften des rekonstituierten Kanals unter Sulfat­Efflux­ Bedingungen machen seine Beteiligung Sulfattransport und somit ­Transport SR sehr unwahrscheinlich. Vielmehr scheint den Transport von Nucleotiden, besonders ATP, SR­Lumen vermitteln. Allerdings weist auch hohe Affinitäten einem speziell synthetisierten GTP­Analogon auf könnte deshalb dem bekannten Eintransport von GTP in SR­Vesikel beteiligt sein. Nucleotide werden SR­Lumen Phos­ phorylierung verschiedener Proteine Sarcalumenin, HCP (histidine­rich protein') und Calsequestrin benötigt, neben ihrer Funktion ­Speicher auch der Regulation ­Release beteiligt sind. den Vesikeln sarcoplasmatischen Reticulums existieren mindestens zwei Proteine, durch Immunodetektion Affinitätsmarkierung mit einem radioaktiv markierten GTP­Analogon nachgewiesen wurden. greifen regulierend in den Anionentransport SR ein, Antikörper gegen G ­Untereinheit dieser Proteine den Sulfattransport hemmen. Diese Wirkung scheint allerdings direkt erfolgen nicht über second messenger'. Einen weiteren Hinweis G­Protein­vermittelte Regulation Anionentransports stellt sehr effiziente Hemmung des Sulfat­Efflux SR­Vesikeln durch Suramin verschiedene Arbeitskreis synthetisierte Suraminderivate Ein Analogon, spezifisch G­Protein­gekoppelten Ionenkanälen (P2Y ­ Purinoceptoren) Wechselwirkung und bindet eine alpha ­Untereinheit der SR­Vesikel. Ein weiteres Derivat, SB 22, zeigt ebenfalls Affinität zu dieser G alpha ­Untereinheit sowie zu einem anderen Protein (40 kDa) und der Ca ­ATPase. ­ATPase keine Transport­ eigenschaften für Sulfat aufweist, muß die hemmende Wirkung auf den Anionentransport entweder durch Modifikation einer Galpha ­Untereinheit oder Zeit noch nicht näher charakterisierten Proteins erfolgen. Der VDAC zeigt Suraminderivaten gegenüber inert und kommt deshalb nicht Sulfattransporter des sarcoplasmatischen Reticulums Frage