Die Rolle der intrazellulären Domäne des CD95-Liganden bei der reversen Signalübertragung

Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.The type II transmembrane protein CD95 ligand (CD95L, FasL) is involved as a death factor in the regulation of activation induced cell death and establishment of immune privilege by inducing apoptosis in CD95 expressing cells. In addition, CD95L may serve as a costimulatory molecule for T-cells. This phenomenon is also documented for other members of the TNF-ligand-family and is called reverse signalling. The intracellular domain of CD95L is highly conserved between different species and contains different signalling motifs like a proline-rich region and a casein kinase I phosphorylation site, that is also present in other members of the TNF-ligand-family that transmit reverse signals. In the context of the reverse signalling capacity of TNF this site is necessary for the reverse signalling capacity. Another observation that has been linked to the proline rich region in the intracellular domain of CD95L is the transport and storage of the ligand in secretory lysosomes of CTLs and NK-cells. After a TCR transduced signal CD95L is transported to the cell surface at the area of contact between T-cell and APC (immunological synapse). To get more insight into the various functions of CD95L a yeast-two-hybrid screen with the intracellular domain of CD95L was performed. With this method I was able to identify 15 different proteins that bound the cytoplasmic tail of CD95L at least in yeast. One of these proteins (FBP11) has already been published as "human fas ligand associated factor". Some of these proteins like the HMG-transcriptionfactor Lef-1, the thymocyte specific protein TARPP, the forming-binding Protein FBP11 and the PTP-interacting protein PSTPIP bound to CD95L in vitro, as shown in GST-pulldown experiments. The interaction of CD95L with PSTPIP, which is an adaptor protein that contains an SH3-proline-binding domain and that is known to bind to different proteins like CD2, c-Abl, WASp or Protein-Tyrosin- Phosphatases, was studied further. During this thesis I could show that PSTPIP binds to the proline-rich region of CD95L via its SH3-domain. This was shown in GST-pulldowns, coimmunopreciptiation experiments and co-localization studies. As PSTPIP binds to the PTPPEST phosphatase via its coiled-coil domain it may serve as a bridging protein that brings PTP-PEST near CD95L to dephosphorylate it. Activation of freshly isolated and purified mouse T-lymphocytes with anti-CD3-antibodies leads to proliferation and expression of activation markers if co-stimulatory molecules like CD28 are co-activated. As published before CD95L can also act as a co-stimulatory molecule. This could be shown in proliferation assays of CD4- and CD8- singlepositive T-cells. Furthermore I could show that the stimulation of the CD95L-molecule with a specific antibody led to the phosphorylation of p42/p44-MAPK in 293-005 cells that stably express CD95L. As the MAPK-cascade is involved in the regulation of proliferation this may be the reason why the reverse signalling of CD95L leads to increased proliferation in T-cells after CD95L-co-stimulation. This phosphorylation was transient and was not influenced by the expression of PSTPIP. Furthermore it was found that CD95L, like its receptor CD95, constitutively localizes to specialized membrane microdomains called lipid rafts and that its apoptosis inducing function was impaired in cells where the lipid rafts were disturbed. This may serve as a further step to regulate the killing capacity of CD95L