Zellzyklus- und Dichteabhängigkeit todesrezeptorvermittelter Apoptose und Untersuchungen des von RKO-Zellen konditionierten Mediums

Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Zellzyklusabhängigkeit der CD95- vermittelten Apoptose besteht. Dazu wurde ein ecdysoninduzierbares Genexpressionsystem für die induzierte Überexpression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 in RKO-Zellen (Kolonkarzinomzellen) zur Herbeiführung eines Zellzyklusarrests in der G1-Phase benutzt. Nach Induktion mit dem Ecdysonhomolog Muristeron wurde durch Zugabe von rekombinanten hCD95-Liganden Apoptose ausgelöst und anschließend untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Induktor Muristeron an sich und nicht die p21- bzw. p27-Überexpression die anti-apoptotische Akt-Kinase aktiviert, die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL erhöht, die Caspase-8-Aktivierung (entweder am CD95-DISC oder durch "Feedback"-Aktivierung durch Caspase-3) und die darauf folgenden Ereignisse verhindert und somit die hCD95L-induzierte Apoptose blockiert. Zusätzlich beeinflusst der Induktor auch das Genexpressionsmuster der behandelten Zellen, was ebenfalls für die Hemmung der Apoptose mit verantwortlich sein könnte. Somit ist das ecdysoninduzierbare Genexpressionsystem zur Apoptoseuntersuchung in RKO-Zellen nicht verwendbar. Mit der Untersuchung des Apoptoseverhaltens proliferierender RKO-Zellen konnte gezeigt werden, dass überlebende Zellen nach hCD95L-Behandlung vermehrt in der G0/G1-Zellzyklusphase nachweisbar sind, während apoptotische (Caspase-3-positive) Zellen aus der G2/M-Phase heraus sterben. Allerdings weisen die apoptotischen Zellen kaum Cyclin B1 auf, ein für die G2-Phase wichtiges und typisches Cyclin. Somit bleibt die genaue Verknüpfung von Zellzyklusregulation und Apoptose auch nach diesen Analysen ungeklärt. In einem dritten Ansatz - Zellzyklusarrest durch Dichtearretierung - konnte eine Hemmung der CD95- vermittelten Apoptose in der arretierten Zellpopulation nachgewiesen werden. Allerdings sekretieren RKO-Zellen einen anti-apoptotischen Faktor in ihr Medium, dessen Konzentration und Wirkung mit größerer Zelldichte zunimmt und somit für die Protektion, unabhängig von Zellzyklusarrest oder Proliferation, verantwortlich ist. Konfluente und auch mit konditioniertem Medium behandelte RKO-Zellen zeigen im Vergleich zu dünn ausgesäten RKO-Zellen Veränderungen, die denen sehr ähnlich sind die beim Übergang einer epithelverankerten Zelle zu einer migrierenden Einzelzelle (EMT) auftreten. Beispielsweise verändert sich die Zusammensetzung des Zytoskeletts, die Zellen verlieren den Zell-Zell-Kontakt und lösen sich ab, bleiben aber am Leben. Zusätzlich steigt die Sekretion von Zytokinen an, die Angiogenese, Migration und Invasion positiv beeinflussen. Sowohl konfluente als auch mit konditioniertem Medium behandelte sub-konfluente Zellen sind apoptoseresistent (hCD95L, TRAIL, UV, Staurosporin), woran u.a. die Kinasen PKC und PI3K, aber auch das anti-apoptotische Bcl-xL beteiligt sind. Die Zellen sterben interessanterweise, wenn ein agonistischer anti-CD95-Antikörper statt des rekombinanten CD95-Liganden verwendet wird, was vermuten lässt, dass eine mangelhafte Vernetzung der einzelnen DISC-Komplexe zur Apoptosehemmung führt, welche durch den Antikörper dann aber erzwungen wird. Zwar handelt es sich hierbei um ein reines Zellkulturmodell, dennoch könnte es bedeuten, dass die Umgebung in einer dichten RKO-Zellkultur vergleichbar ist mit der in größeren soliden Tumoren. Die Zellen brauchen Nährstoffe, versuchen über eine Neovaskularisierung Anschluss an ein Blutsystem zu finden und sekretieren Lockstoffe, Wachstumsfaktoren sowie Proteasen, um die Metastasierung zu erleichtern. PI3K, cPKCs und Bcl-xL tragen dabei zu einer Apoptoseresistenz bei, welche die Zellen zum einen resistent gegenüber Anoikis, Nährstoffmangel, aber auch gegen angreifende zytotoxische T-Zellen macht. Eine weitere Aufklärung der hier ablaufenden Prozesse würde es erleichtern, Möglichkeiten zu finden, in diese Signalwege einzugreifen, um die Apoptosesensitivität wieder herzustellen und die Metastasierung zu verhindern. Insbesondere ist die Identifizierung des für die Apoptoseprotektion verantwortlichen Zytokins das nächste wichtige Ziel bei der Fortsetzung dieser Arbeiten.The aim of this study was to investigate whether a cell cycle dependency in CD95 mediated apoptosis exists. Therefore an ecdysone-inducible expression system was used to induce overexpression of the CDK-inhibitors p21 and p27 in RKO cells (colon carcinoma cell line) to arrest then in the G1 cell cycle phase. Upon transgene induction with the ecdysone homologue muristerone, apoptosis was induced via addition of recombinant hCD95 ligand and then further analyzed. The results demonstrate that muristerone itself and not the overexpression of p21 or p27 activates the anti-apoptotic Akt kinase, increases expression levels of anti-apoptotic Bcl-xL, inhibits caspase-8 activation (possibly at the CD95 DISC or alternatively at the level of feedback activation by caspase-3) as well as downstream events, and therefore inhibits hCD95L-induced apoptosis. Additionally the inductor influences the gene expression profile of treated cells, which could also be involved in the inhibition of apoptosis. In conclusion, these data show that the Ecdysone-inducible gene expression system is not useful to study apoptosis in RKO cells. By investigating apoptotic behavior of proliferating RKO cells the observation was made that, upon hCD95L treatment, surviving cells are more likely to be found in the G0/G1-cell cycle phase. Apoptotic (caspase-3 positive) cells preferentially die from G2/M-phase as judged by the DNA profile, although they do not express the G2/M-typical cyclin B. Therefore, the question of a direct link between cell cycle and apoptosis still remains open. In a third approach - cell cycle arrest via contact inhibition of dense cells - an inhibition of CD95- mediated apoptosis in cell cycle arrested cells could be proven. Further analysis revealed that RKO cells secret an anti-apoptotic factor into the medium, with increasing concentration (and effectiveness) with higher cell density. This factor is responsible for apoptosis protection, independently of cell cycle arrest or proliferation. Dense RKO cells and cells plated at low density before treatment with conditioned medium show changes similar to those in epithelial-mesenchymal transition (EMT) if compared to sparsely seeded RKO cells: cytoskeleton reorganization, loss of cell-cell-contact, loss of adherence and anoikis resistance. In addition, secretion of angiogenesis-, migration- and invasion-inducing cytokines increases. Dense, as well as sparse cells treated with conditioned medium are apoptosis-resistant (hCD95L, TRAIL, UV, staurosporine). The kinases PKC and PI3K and the anti-apoptotic Bcl-xL contribute to the resistance phenotype. The cells die however if treated with anti-CD95-antibody, suggesting an insufficient clustering of single DISC-complexes and inhibition of apoptosis when the cells are treated with recombinant hCD95 ligand. The agonistic CD95-antibody on the other hand forces DISC clustering. This cell culture model may be comparable to the situation in large solid tumors. The cells need nutrients, try to connect to the vascular system through angiogenesis and secrete chemoattractants, growth factors and proteases to facilitate metastasis formation. PI3K, cPKC and BclxL induce apoptosis resistance, which protects cells against anoikis, serum deprivation and cytotoxic T cells. Further investigations of underlying mechanisms could provide new targets to manipulate the signaling pathways in order to restore apoptosis sensitivity in tumor cells and to prevent metastasis formation. In this context, it will be highly interesting to identify the anti-apoptotic factor secreted by RKO cells